目的据统计,肝癌在全球肿瘤发病率中居第六位,在恶性肿瘤致死率中居第二位,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)约占肝癌总发病率的78%。HCC是一类富血管恶性实体肿瘤,起病隐匿、发展迅速、易于复发及侵袭转移,而肿瘤内的新生血管生成在HCC的发展及侵袭转移过程中发挥着极其重要的作用。目前,靶向干预肿瘤血管生成的药物及其相关作用机制研究已成为关注热点。索拉非尼是目前临床上唯一用于治疗晚期肝细胞肝癌的分子靶向药物,其具有明显抗肝癌细胞增殖及抑制肝癌血管生成的作用,可提高晚期肝癌患者中位生存期约2-3月。然而,索拉非尼的耐药性成为限制其临床广泛应用的重要因素之一。因此,探索新型的血管生成抑制剂及其相关作用机制的研究可为索拉非尼的替代治疗或联合用药方案的制定提供新的实验理论依据。肿瘤抑素(Tumstatin)是源于Ⅳ型胶原蛋白α3链的新型内源性血管生成抑制剂,其主要通过降低哺乳动物雷帕霉素靶体(mammalian target of rapamycin, mTOR)活性抑制内皮细胞(endothelial cell,EC)内蛋白质的合成及其增殖,发挥其抗血管生成作用。T7肽是全长Tumstatin内的74-98氨基酸残基序列,其具有与全长的Tumstatin相同的抗血管生成活性,且L、V、D氨基酸是T7肽发挥抗血管生成活性的主要氨基酸。但是T7肽具体调控机制尚不甚明确。因此,探索与T7肽抑制血管生成活性相关的信号通路及下游靶蛋白和靶基因可为未来T7肽的临床成药的可能性及应用提供理论实验依据。血管生成素(Angiopoietin,Ang)是除血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)外另一重要的促血管生成因子,其蛋白家族主要包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,其中Ang-2主要存在于内皮细胞的韦伯潘力氏小体(Webel Paladebody,WPB)。在肿瘤缺氧微环境下,Ang-2可由WPB快速释放,促进血管内皮细胞与细胞外基质及内皮细胞间的解离,活化并促进内皮细胞的迁移,同时可增强内皮细胞对VEGF的敏感性,进而促进血管生成。而且在肝癌组织中Ang-2蛋白表达也被发现明显增加,并伴有肝细胞肝癌血管生成增加,可加速肝细胞肝癌的发展及侵袭转移。作为调控肿瘤血管生成的重要分子蛋白,Ang-2的具体作用机制及其在T7肽抑制血管生成过程中的作用具有重要研究意义。自噬(Autophagy)是细胞利用自身溶酶体降解胞内损害的细胞器和大分子物质的过程。自噬在血管生成中的作用已引起人们的重视,而某些血管生成抑制剂可诱导脐静脉内皮细胞自噬的增加,增强内皮细胞抗凋亡能力,进而拮抗甚至逆转血管生成抑制剂的抗血管生成活性,在一定程度上阻止了抗血管生成药物的效果。因此,联合自噬抑制剂如3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)以增强抗血管生成药物的敏感性已进入人们的研究视野。3-MA可靶向作用于Ⅲ型P13K,抑制吞噬泡对胞内成分的包裹,进而达到其抑制自噬的目的。靶向干预肝细胞肝癌血管生成的分子药物研究对于延长肝癌患者的生存期及改善远期预后至关重要。我们主要探寻Tumstatin中具有抗血管生成活性的T7肽片段调控的相关信号通路及下游可能的调控靶蛋白,以及促血管生成因子Ang-2在T7肽的抗血管生成活性中的作用,并进一步研究T7肽与内皮细胞自噬之间的相关性及其对血管生成的影响。方法1.人肝癌细胞系HepG2裸鼠异位成瘤,随机分为对照组和实验组(n=15),分别腹腔给予生理盐水和T7肽(4.4mg/Kg),22天后裸鼠脱颈处死,获取肿瘤标本,蜡块包埋切片,通过免疫组织化学方法,检测肿瘤组织内VE-钙粘蛋白和CD31蛋白的表达,分析T7肽在体内是否存在抑制血管生成作用。2.我们选取人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein cells,HUVECs)作为体外实验对象,缺氧培养箱提供细胞培养缺氧环境(37℃,1% O2,5% CO2,94% N2),分别设置为常氧组、缺氧组、T7肽(1.0μM)+缺氧组,体外小管形成实验进一步分析体外T7肽在缺氧环境下对于血管生成的影响。3.为明确T7肽抑制血管生成的相关机制,在缺氧环境下HUVECs用不同浓度T7肽(0.25μM,0.5μM,1.0μM,2.0μM)处理24 h, CCK-8法观察细胞活力变化,并选取T7肽(1.0μM)进行后续实验。在缺氧环境下T7肽分别处理HUVECs12h和24h,通过CCK-8法观察细胞活力变化。4.对数生长期HUVECs分别设置为常氧组、缺氧组、缺氧+T7肽组,培养24 h后,Annexin V-FITC法检测细胞凋亡情况。提取细胞总蛋白后,Western blot法检测细胞相关凋亡蛋白Bax及Bcl-2的表达情况。5.为明确Ang-2是否为T7肽的调节靶点及其相关信号通路,我们在上述实验基础上加入缺氧+MK2206 (5.0 μM)组,MK2206为Akt特异性抑制剂,可作为缺氧+T7肽组的阳性对照组,培养HUVECs 24 h,提取细胞蛋白,通过Western blot法检测相关蛋白Ang-2、Akt、p-Akt的表达情况。6.在方法4实验分组的基础上,我们加入缺氧+T7肽+rhAng-2 (15ng)组,分别通过细胞划痕实验和Transwell法观察内皮细胞迁移能力变化。7.探索T7肽及Ang-2在肝癌细胞侵袭方面的作用,我们Transwell板上室接种HepG2细胞,下室接种HUVECs,下室HUVECs设置为常氧组、缺氧组、缺氧+T7肽组、缺氧+T7肽+rhAng-2组,留取下室细胞培养上清液,ELISA法检测细胞培养上清内Ang-2表达,Transwell法观察HepG2细胞的侵袭能力变化。6孔板内HUVECs设置为上述4组,留取细胞培养上清液,离心后用于培养HepG2细胞,24 h后提取总蛋白,Western blot法检测肝癌细胞内MMP2的表达情况。8.为探索T7肽在细胞自噬方面的作用,我们首先在缺氧环境下用T7肽处理脐静脉内皮细胞,丫啶橙染色观察自噬溶酶体形成情况。然后在相同条件下设置3-MA组、T7肽组、T7肽+3-MA(5.0 nM)组,再次丫啶橙染色观察自噬溶酶体形成情况,Western blot法检测内皮细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达情况。9.为明确3-MA在T7肽抑制血管生成中的作用,HUVECs设置为缺氧组、缺氧+3-MA组、缺氧+T7肽组、缺氧+T7肽+3-MA组,通过小管形成实验观察体外3-MA和T7肽对于血管生成影响,Annexin V-FITC法检测内皮细胞凋亡率。结果1.人肝癌细胞HepG2裸鼠异位肿瘤模型建立,腹腔分别给予生理盐水和T7肽处理,免疫组织化学染色结果显示T7肽明显抑制肿瘤内两个重要血管内皮细胞标志物VE-钙粘蛋白和CD31蛋白的表达。体外小管形成实验也同时显示缺氧情况下T7肽明显逆转缺氧诱导的血管形成增加(P<0.01)。2.T7肽可明显抑制内皮细胞活力,且具有浓度依赖性。T7肽浓度为0.5μM时内皮细胞活力高于1.0μM,但二者无统计学意义。T7肽浓度为2.0μM时内皮细胞活力低于20%。选取T7肽浓度为1.0μM进行下一步实验,CCK-8法检测显示T7肽处理24小时的内皮细胞活力明显低于T7肽处理12小时的内皮细胞活力(P<0.05),且相同时间点T7肽可明显抑制缺氧条件下内皮细胞的活力。3. Annexin V-FITC检测显示缺氧环境可以降低内皮细胞的凋亡率。相反,T7肽可明显增加缺氧下内皮细胞的凋亡率(P<0.01)。Western blot结果显示T7肽可以逆转缺氧对于促凋亡蛋白Bax的下调和抗凋亡蛋白Bcl-2的上调(P<0.01)。4. Western blot显示缺氧可以诱导Ang-2蛋白表达水平的上调,并同时增加Akt的磷酸化水平(P<0.01)。但是,缺氧环境下T7肽可明显降低内皮细胞Ang-2蛋白的表达水平,抑制Akt的磷酸化(P<0.01)。我们也发现Akt特异性抑制剂MK2206在抑制Akt磷酸化水平同时可明显下调Ang-2的表达水平(P<0.01),与T7肽具有相同的下游调节靶点蛋白。因此,T7肽可以通过下调Akt的磷酸化水平降低Ang-2的表达水平。5.细胞划痕实验结果发现,T7肽可以明显抑制缺氧诱导的内皮细胞迁移能力的增加(P<0.05)。联合应用外源性rhAng-2,内皮细胞迁移能力较单独使用T7肽处理时明显增强(P<0.05)。结果表明Ang-2蛋白可以增加内皮细胞的迁移能力。Transwell实验结果与细胞划痕实验结果一致。6. ELISA法检测发现,缺氧下胞外Ang-2蛋白水平明显升高,T7肽可抑制上述过程(P<0.01)。同时我们发现含有高浓度Ang-2的HUVECs培养上清液可明显促进肝癌细胞侵袭(P<0.05)及MMP2蛋白的表达(P<0.01)。T7肽可通过降低内皮细胞Ang-2的释放间接调控肝癌细胞的侵袭能力。7.丫啶橙染色显示T7肽可诱导内皮细胞自噬溶酶体增加,自噬抑制剂3-MA可逆转此过程,Western blot显示LC3-Ⅱ蛋白表达水平可被T7肽明显提高(P<0.01)。自噬抑制剂3-MA在缺氧环境下可诱导内皮细胞凋亡,降低体外血管生成(P<0.01)。联合自噬抑制剂3-MA,T7肽导致的细胞凋亡率较单独使用T7肽时明显增高(P<0.01),小管形成实验亦显示联合应用3-MA和T7肽具有更强的抑制血管生成能力(P<0.05)。结论1.缺氧环境下T7肽在体内及体外均具有明显抑制血管生成作用。2.T7肽可以通过促进内皮细胞的凋亡和抑制内皮细胞活力发挥其抗血管生成活性。3.T7肽可通过靶向抑制Ang-2表达而降低内皮细胞迁移能力,进而抑制血管生成。磷酸化的Akt水平降低在二者之间起“桥梁”作用。4.T7肽可通过下调Ang-2表达抑制肝癌细胞的侵袭转移。Ang-2在肿瘤的侵袭中发挥重要作用。5.自噬抑制剂3-MA可抑制血管生成,并能协同增加T7肽在降低血管生成和增加细胞凋亡中的作用。同时可推测T7肽诱导的内皮细胞自噬增强可在一定程度上拮抗T7肽的抑血管生成作用。意义1.发现了T7肽可通过促进内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞迁移及活力发挥其抗血管生成作用。2.证实Ang-2可作为T7肽抗血管生成作用的调控靶点,并发现Akt通路的“桥梁”作用,为T7肽及Ang-2在肿瘤血管生成方面的进一步研究提供实验理论依据。3.揭示了T7肽可通过调控Ang-2表达发挥抗血管生成及抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用。4.自噬抑制剂可增强T7肽的抗血管生成活性,为未来肿瘤治疗的联合用药研究提供依据。5.T7肽作为重要的肿瘤血管生成抑制剂,其作用机制的研究对于新型抗肿瘤血管生成药物的研发具有重要意义。