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毛蚶(Scapharca kagoshimensis)隶属于软体动物门瓣鳃纲,是一种具有重要经济价值的海洋无脊椎动物,同时又是一类较特殊的含有血红蛋白(hemoglobin,Hb)的双壳贝类。因其没有T细胞,缺乏真正意义上的抗体、没有类似脊椎动物的特异性免疫系统,因而只能依靠血细胞及体液因子的先天免疫反应来抵御外界环境中病原微生物的入侵,其中尤以血细胞在机体的防御机制中发挥主导作用。Hb是存在于所有脊椎动物和部分无脊椎动物中的一大类具有可逆载氧能力的含铁蛋白,最近的研究发现其除具有运输氧气的功能外,还具有稳定血压、抗菌、运输硫化物、调节酸碱平衡等多种生物学功能,具有极高的理论研究价值。本研究拟利用Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析纯化技术和AmiconUltra-4超滤浓缩技术从毛蚶血细胞裂解物中分离纯化出二聚体和四聚体形式的两种Hb(HbⅠ,HbⅡ);以L-DOPA为底物证实其能够发挥类酚氧化酶活性(PO-likeactivity),并对其生化性质进行鉴定;以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌、大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、青霉、黑曲霉、面包酵母和裂殖酵母为指示菌,研究毛蚶HbⅡ和HbⅠ的抗菌活性,并以甲醚化海萤荧光素类似物(MCLA)为化学发光探针,同时结合超氧化物歧化酶(SOD)的特异性抑制实验对毛蚶HbⅡ和HbⅠ的抗菌机理进行研究,旨在揭示毛蚶Hb在非特异性免疫反应中的作用并为进一步探索其分子机理奠定基础。
本文利用Selohacryl S-100凝胶过滤柱层析纯化技术和Amicon Ultra-4超滤浓缩技术从毛蚶血细胞裂解物中分离纯化出了三种Hb组分,其在SDS-PAGE电泳中显示为分子量分别为30.28 kDa、28.9 kDa和31.2 kDa的三个条带,质谱鉴定结果证实,30.28 kDa.和28.9 kDa组分为HbⅡ的两个亚基,31.2 kDa组分为HbⅠ,而凝胶过滤法测得的HbⅡ分子量为57.8 kDa,与上述结果相符。酶活性检测结果显示,HbⅡ和HbⅠ在非激活的自然状态下对L-DOPA底物均具有类酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性,且其PO活性均可被异丙醇所进一步激活,而不为SDS、胰酶和尿素所激活。
生物化学和酶性质检测结果表明,毛蚶HbⅡ对L-DOPA底物的类PO活性的最适反应温度为40℃、最适反应pH值为7.0,而HbⅠ对L-DOPA底物的类PO活性的最适反应温度为50℃、最适反应pH值为7.0。HbⅡ和HbⅠ对L-DOPA、儿茶酚和对苯二酚均具有类PO活性,但不能氧化酪氨酸和苯酚;在最适反应条件下,HbⅡ对L-DOPA、儿茶酚和对苯二酚的Km值分别为1.22 mM、2.71 mM和0.97 mM,HbⅠ对L-DOPA、儿茶酚和对苯二酚的Km值分别为2.0 mM、5.27mM和1.55 mM,证明HbⅡ和HbⅠ均为同时具有儿茶酚酶与漆酶性质的类PO。氧化酶抑制剂检测结果显示,亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸和半胱氨酸对HbⅡ和HbⅠ的类PO活性具有很强的抑制作用,而苯甲酸、苯硫脲和硫脲的抑制作用较弱,表明毛蚶HbⅡ和HbⅠ发挥类PO活性时均更像是一种儿茶酚酶性质的PO。金属(酸)合剂和金属离子检测结果显示,EDTA能强烈抑制HbⅡ和HbⅠ的类PO活性,DETC、Cu2+、Zn2+、Mg2+和Ca2+对其类PO活性具有不同程度的抑制作用,而Fe2+对其类PO活性则具有显著的激活作用,且被EDTA抑制的类PO活性可被Fe2+完全回复,说明毛蚶HbⅡ和HbⅠ均为金属蛋白酶,与Hb是一种含Fe蛋白的性质是一致的。综上所述,毛蚶HbⅡ和HbⅠ在发挥类PO活性时同时具有儿茶酚酶与漆酶双重性质且更像是一种儿茶酚酶的含Fe金属蛋白酶。
对毛蚶Hb体外抗菌活性的检测结果发现,毛蚶HbⅡ对三种革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和四联微球菌的MIC分别为0.373 mg/mL、0.186mg/mL和0.047 mg/mL,HbⅠ对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和四联微球菌的MIC分别为1.910 mg/mL、0.060 mg/mL,和0.060 mg/mL,但二者对大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌、鳗弧菌和哈维氏弧菌等革兰氏阴性菌以及青霉、黑曲霉、面包酵母和裂殖酵母等真菌均没有杀菌作用。以甲醚化海萤荧光素类似物(MCLA)为化学发光探针对毛蚶Hb抗菌机理的研究结果显示,毛蚶HbⅡ和HbⅠ均能够产生活性氧(ROS),且所产生的ROS可为超氧化物歧化酶(SOD)所特异性抑制,说明HbⅡ和HbⅠ所产生ROS的类型为超氧阴离子。由此可见,毛蚶HbⅡ和HbⅠ对革兰氏阳性菌具有杀菌活性,其杀菌活性的分子机理是通过产生超氧阴离子ROS来实现的。
本文首次对毛蚶Hb的类PO性质及其非特异性免疫活性的研究,对于揭示Hb在无脊椎动物非特异性免疫系统中的作用以及呼吸蛋白分子的多重生物学功能具有重要的理论意义。