苯是一种常见的工业原料和环境污染物。长期苯暴露可导致严重的造血系统的损伤，主要表现为白细胞、粒细胞和血小板减少，严重者出现再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合症甚至白血病。1,4苯醌是苯在骨髓中的代谢终产物之一，苯的毒性作用机制主要与其氧化代谢产物导致的氧化损伤、基因突变和染色体畸变等相关。　　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-Phosphate dehydrogenase，G6PD）缺乏症是一种常见红细胞溶血性疾病，俗称“蚕豆病”，全球近4亿人受累。G6PD作为磷酸戊糖路径（Pentose phosphate pathway，PPP）的初始酶，通过催化合成NADPH、维持谷胱甘肽的还原性保护细胞免受活性氧簇（ROS）的损害。　　自噬(autophagy)，也被称为“自我吞噬”，是细胞依赖溶酶体降解和回收利用细胞内长寿命蛋白与细胞器的过程。自噬通常在饥饿、缺氧、氧化应激、炎症反应等不利因素诱导下激活，为机体提供能量、维持细胞动态平衡。　　课题组前期研究表明，G6PD缺陷可以增加K562细胞苯醌暴露所致的氧化损伤和细胞增殖毒性效应，本研究将进一步探讨G6PD缺陷对苯醌导致细胞自噬的影响及机制。本课题首先选用1,4-BQ染毒K562细胞，研究1,4-BQ对K562细胞自噬的影响及作用机制；进而通过构建G6PD低表达K562细胞株，检测1,4-BQ作用后细胞自噬活性的改变，研究G6PD对细胞自噬的调控及G6PD对1,4-BQ诱导细胞自噬的调控作用。最后通过加入还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH），检测GSH干预后1,4-BQ诱导G6PD低表达细胞自噬水平的变化，探讨G6PD调控1,4-BQ所致自噬的可能作用机制。　　一．1,4苯醌对K562细胞自噬的影响及机制　　1,4-BQ染毒K562细胞后，通过检测CYTO-ID自噬活性、溶酶体的pH值、LC3-Ⅱ和P62的蛋白表达水平及LC3和P62的mRNA表达水平，研究1,4-BQ对K562细胞自噬活性的影响。结果显示1,4-BQ作用后K562细胞CYTO-ID自噬水平增加、细胞溶酶体pH降低、LC3和P62的mRNA水平及LC3-Ⅱ和P62的蛋白表达水平均显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明1,4-BQ可引起K562细胞自噬活性增加或者自噬流受阻。　　为探讨1,4-BQ对K562细胞自噬流的影响，首先通过加入自噬早期抑制剂LY294002，检测1,4-BQ诱导K562细胞自噬水平的变化。结果显示LY294002作用后，1,4-BQ诱导CYTO-ID自噬水平降低，LC3-Ⅱ蛋白含量下降（P＜0.05）。然后加入自噬流阻断剂CQ后，检测自噬流阻断对1,4-BQ诱导K562细胞自噬活性的影响，结果显示CQ作用后，1,4-BQ诱导的CYTO-ID自噬水平和LC3-Ⅱ蛋白含量未见明显改变（P＞0.05）。以上结果表明1,4-BQ诱导K562细胞自噬的同时阻断自噬流。　　1,4-BQ染毒K562细胞后，检测PI3K/AKT/mTOR自噬通路上关键蛋白的表达，结果显示1,4-BQ染毒后PI3K（P85）蛋白表达水平下降，AKT和mTOR的磷酸化水平受抑制（P＜0.05）。结果表明1,4-BQ通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导K562细胞自噬。　　最后通过LY294002抑制早期自噬体合成，检测1,4-BQ染毒K562细胞后细胞增殖率、ROS含量、细胞凋亡率和脂质过氧化（MDA）水平的变化，研究自噬在1,4-BQ致K562细胞毒性中的作用。结果显示LY294002抑制自噬后，K562细胞增殖抑制率降低，细胞ROS含量、细胞凋亡率及脂质过氧化（MDA）水平均显著下降（P＜0.05）。结果表明LY294002抑制自噬可减轻1,4-BQ对K562细胞产生的氧化损伤。　　二．G6PD低表达对1,4苯醌致K562细胞自噬作用的影响　　G6PD在保护细胞免受氧化剂尤其是过氧化物的损害中具有重要作用，G6PD缺陷会增强苯醌对K562细胞产生的氧化损伤。本研究通过构建G6PD低表达的K562细胞，检测1,4-BQ处理后自噬活性的改变，研究G6PD调控1,4-BQ致K562细胞自噬作用的可能机制。　　首先检测G6PD正常及低表达K562细胞的自噬水平，研究G6PD对K562细胞自噬的调控作用。结果显示与G6PD正常细胞相比，G6PD低表达细胞自噬水平明显下降，表现为自噬体和自噬溶酶体数量减少、LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低同时LC3的mRNA表达水平也相应降低（P＜0.05）。结果表明G6PD低表达引起K562细胞的自噬活性降低。　　0、10and20μmol/L1,4-BQ染毒G6PD正常及低表达K562细胞，透射电镜法检测自噬形态学改变、Western blot法检测自噬相关蛋白表达量。结果显示1,4-BQ作用后，与阴性对照细胞相比，G6PD低表达细胞的自噬体和自噬溶酶体数量显著增多，LC3-Ⅱ和P62蛋白含量增加同时LC3和P62的mRNA表达水平也相应增加（P＜0.05）。结果表明G6PD缺陷调控1,4-BQ所致K562细胞自噬水平增加。　　加入GSH，检测1,4-BQ诱导G6PD正常及低表达K562细胞自噬水平的变化。结果显示GSH干预后，G6PD低表达细胞的LC3-Ⅱ和P62蛋白表达明显降低且与阴性对照细胞差异减小（P＞0.05）。结果表明GSH可降低1,4-BQ诱导G6PD低表达细胞产生的自噬水平。另外，GSH干预后PI3K（P85）蛋白表达增加，AKT、P-AKT、mTOR和P-mTOR的表达也相应增加，结果表明GSH可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号途径降低1,4-BQ诱导的细胞自噬。　　总结：　　本研究发现1,4-BQ通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活K562细胞自噬，同时1,4-BQ在一定程度上影响自噬的降解过程阻碍自噬流的发生；通过LY294002抑制1,4-BQ诱导的过度自噬，能够显著减轻K562细胞的氧化损伤和增殖毒性。通过构建G6PD低表达K562细胞模型，结果表明G6PD低表达能够增强1,4-BQ诱导K562细胞产生的细胞自噬，还原性谷胱甘肽可显著降低1,4-BQ所致G6PD低表达细胞自噬水平的增加。以上研究为G6PD缺陷对苯醌毒性易感性增加的机制提供理论基础。