肿瘤标志物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶与食品中黄曲霉毒素的检测方法研究

来源 :东南大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:wxy20009
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寻找具有较高特异性和灵敏度的肿瘤标志物对于肿瘤的早期诊断和治疗具有一定的临床价值。随着肿瘤研究的不断发展,人们对肿瘤的认识越来越深,新型肿瘤标志物也不断被发现。许多研究结果显示聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)与肿瘤的产生、发展等行为密切相关,而且在癌细胞中PARP-1的表达水平明显高于正常细胞。PARP-1可作为肿瘤诊断和预后的重要生物指标。本文构建了两种分别基于紫外-可见法和荧光法的比色传感器,用于对癌症相关酶类生物标志物PARP-1的定性和定量检测。黄曲霉类毒素主要是由黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物,通常被认为是最有效的致癌物、诱变剂和致畸剂。在黄曲霉毒素家族中,以黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量最高、毒性最大。因此,考虑到AFB1的毒性和危害性,开发可靠又灵敏的分析方法对食品安全检测至关重要。本文构建了电化学适体传感器,用于AFB1的含量检测。本文的主要内容如下:(1)基于金纳米棒(AuNRs)的正电性特征和其独特的光学性质,建立了一种无标记的紫外-可见光谱法检测PARP-1活性。首先PARP-1被特定的双链DNA激活后,将细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)裂解为ADP核糖元和烟碱胺两部分,随后ADP核糖基团转移至PARP-1上。通过反复催化,导致在PARP-1上形成负电性的多聚ADP核糖聚合物(PAR)。当PAR存在时,通过静电相互作用,负电性的PAR诱使正电性的金纳米棒发生自组装,从而引起金纳米棒的局部表面等离子体共振(LSPR)峰对应值降低,继而观测到溶液颜色变化。根据AuNRs在745 nm处紫外吸收峰值的变化对PARP-1进行定量检测。该方法的线性范围为0.05-1.0 U,检出限为0.006 U,与之前报道的方法相比较,其检出限降低了两个数量级,方法更加简单、灵敏,操作更加简便、快速。该方法还能用于评估PARP-1抑制剂的抑制效率,检测PARP-1在各种DNA损伤中的活性变化。(2)基于阳离子共轭聚合物(PFP)以及二氧化锰纳米片(MnO2)的光学性质,构建了一种超灵敏的荧光比色法检测PARP-1活性。首先,在380 nm的波长激发下,阳离子共轭聚合物PFP在424 nm处呈现出很强的荧光吸收峰。在加入MnO2纳米片后,由于发生荧光共振能量转移(FRET),PFP的荧光被MnO2纳米片猝灭。当加入扩增好的负电性的PAR时,通过静电作用,正电性的MnO2从PFP表面脱离下来,使得PFP的荧光信号恢复。随着PARP-1的含量越多,荧光信号越强。该方法具有更宽的线性范围0.03-1.5 U,以及更低的检出限0.004U,而且在手提式紫外灯照下(365 nm),溶液会发出蓝色荧光,随着PARP-1含量的增多,荧光颜色逐渐由浅色变为深蓝色。根据颜色变化和424 nm处荧光强度变化可以实现PARP-1活性的半定量和定量检测。而且该方法已经成功用于乳腺癌细胞SK-BR-3和人血清中PARP-1的活性检测,检测结果与人类PARP试剂盒的检出结果相一致。(3)利用β-环糊精的主客体相互作用设计了一个简单的电化学适体传感器检测AFB1的含量。由于β-CD分子腔径及Fc分子的大小,一个β-CD分子腔内最多只能容纳一个Fc分子。当不存在AFB1时,两侧同时修饰Fc的双链DNA无法进入β-CD内;当AFB1存在时,由于AFB1与Fc-AFB1适体之间的特异性作用使得Fc-cDNA从双链DNA中释放出来,并进入β-CD内形成包覆的络合物修饰在电极表面,从而引起电极表面Fc电化学信号的变化。AFB1的加入量越多,电化学信号越强,以此实现AFB1的定量检测。该传感器可以同时利用示差脉冲法和交流阻抗法进行AFB1含量检测,极大地提高了检测灵敏度。
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