背景曲妥珠单抗作为一种有效的靶向治疗药物,目前已广泛用于人类表皮生长因子受体2（Human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阳性乳腺癌患者的治疗,并在临床上已取得巨大的成功。但由于部分患者先天性对曲妥珠单抗缺乏敏感性,约仅有12%-34%患者有效,并且有近50%的患者容易在用药一年内发生耐药现象,导致治疗的失败。因此,深入研究曲妥珠单抗耐药的潜在作用机制改善临床疗效使更多患者获益具有重要社会价值。促红细胞生成素产生肝细胞受体A5（Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A5,EPHA5）作为一种受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTK）,已被证实可以参与多种肿瘤的发生发展过程,并且与细胞休眠影响肿瘤药物治疗密切相关。然而,至今为止,EPHA5在HER2阳性乳腺癌中的临床意义及其在曲妥珠单抗耐药中所起的作用及机制尚不清楚。目的利用体外和体内实验,研究EPHA5是否可能通过调节乳腺癌干细胞样特性,从而在曲妥珠单抗耐药性中发挥作用。方法1、收集88例接受过曲妥珠单抗治疗的HER2阳性乳腺癌患者的肿瘤组织石蜡包块,用于免疫组织化学分析,检测乳腺癌组织中EPHA5的蛋白表达水平,分析HER2阳性乳腺癌患者中EPHA5表达量与患者年龄、绝经状态、病理分级、激素受体（HR）状态、淋巴结转移状态以及肿瘤TNM分期之间的相关性。结合患者生存情况,评估EPHA5的表达水平是否对HER2阳性乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗的预后具有影响作用。收集曲妥珠单抗敏感和耐药的HER2阳性乳腺癌患者的血样（HER2阳性乳腺癌诊断是根据ASCO/CAP指南）各20例,利用qRT-PCR检测两组（曲妥珠单抗耐药组和敏感组）患者血浆中EPHA5的表达量。评估EPHA5的表达量高低与曲妥珠单抗耐药之间是否具有相关性。2、利用CRISPR/Cas9技术在曲妥珠单抗敏感的SKBR3细胞系中构建EPHA5敲除细胞株SKBR3-KO,同时利用慢病毒技术在曲妥珠单抗耐药JIMT-1细胞系中构建EPHA5稳定过表达细胞株JIMT-1-OE。通过CCK-8实验分别检测曲妥珠单抗处理的SKBR3-KO细胞（空载为对照）以及JIMT-1-OE细胞（空载为对照）活力情况。通过流式细胞技术观察曲妥珠单抗处理的EPHA5敲除以及过表达对曲妥珠单抗作用细胞周期和凋亡的影响情况。3、利用细胞表面标志物CD44⁺/CD24^-/low分离乳腺癌干细胞（Breast cancer stem cells BCSCs）,利用qRT-PCR和Western Blot检测EPHA5对肿瘤干细胞标志物的调控情况。通过干细胞成球培养明确EPHA5敲除SKBR3（空载为对照）乳腺癌细胞或EPHA5过表达JIMT-1细胞（空载为对照）调节干细胞干性能力。进一步利用来源EPHA5缺失的乳腺癌细胞株SKBR3-KO和对照组细胞分离的CSCs注射于裸鼠乳腺脂肪垫,一周后给予曲妥珠单抗治疗,观察EPHA5缺失对裸鼠成瘤、体内转移以及生存的影响情况,在体内评价EPHA5对曲妥珠单抗治疗的疗效影响情况。4、利用免疫荧光细胞染色试验和Western Blot在HER2阳性乳腺癌细胞中观察EPHA5对Notch1和PI3K/AKT信号通路影响情况。并通过挽救实验,Notch1抑制剂FLI-06和PBS处理SKBR3-KO细胞以及空载对照组,应用凋亡实验,细胞周期分析和CSCs干性维持实验验证EPHA5是否通过Notch1信号通路调控乳腺癌干细胞干性能力进而影响曲妥珠单抗敏感性。结果1、在应用曲妥珠单抗治疗的88例HER2阳性乳腺癌组织标本中,EPHA5蛋白的表达与乳腺癌的临床分期（P=0.036）和淋巴结转移状态（P=0.033）之间存在明显的相关性。与患者年龄（P=0.348）、绝经状态（P=0.087）、肿瘤分级（P=0.383）以及ER（P=0.868）和PR（P=0.595）水平无明显相关性。Cox回归分析显示在88例患者中,淋巴结转移状态（P=0.006,HR=0.345,95%CI=0.217-0.549）和EPHA5表达水平（P=0.032,HR=0.231,95%CI=0.149-0.359）是患者总生存（OS）的独立影响因素。Kaplan-Meier曲线分析揭示,EPHA5低表达与HER2阳性乳腺癌患者接受曲妥珠单抗治疗预后不佳之间有显著的相关性（log-rank test,P=0.0353）。40例患者血浆中结果显示,EPHA5在曲妥珠单抗耐药的HER2阳性乳腺癌患者血浆中表达明显低于敏感组。2、Western Blot结果显示SKBR3-KO细胞中EPHA5表达阴性;JIMT-1-OE细胞中EPHA5表达水平明显升高（相对于对照组）。CCK8实验和凋亡实验结果表示,EPHA5缺失的乳腺癌细胞SKBR3对曲妥珠单抗的敏感性明显低于对照组;而EPHA5过表达的乳腺癌细胞JIMT-1对曲妥珠单抗的敏感性明显高于对照组。流式细胞周期实验结果表明,EPHA5过表达可使细胞周期阻滞在S期。3、来源于SKBR3-KO的CSCs的干细胞标志物NANOG,CD133和CD44明显高于对照组,而E-cadherin、CD24明显低于对照组;来源于JIMT-1-OE的CSCs的干细胞标志物NANOG,CD133和CD44明显低于对照组,而CD24、E-cadherin明显高于对照组。干细胞成球培养显示,来源于SKBR3-KO的CSCs成球能力明显高于对照组,来源于JIMT-1-OE的CSCs成球能力明显低于对照组。裸鼠体内实验显示,SKBR3-KO组裸鼠肺和肝的肿瘤转移灶明显对于对照组;SKBR3-KO组裸鼠体重以及生存时间都低于对照组。4、Western Blot结果证明在敲除EPHA5的SKBR3细胞系中和过表达EPHA5的JIMT-1细胞系中,EPHA5能够调控Notch1信号通路相关蛋白NICD、Hes1、Hey1以及PI3K/AKT通路相关蛋白PTEN、AKT的变化。挽救实验中,分别利用Notch1抑制剂FLI-06和PBS处理SKBR3-KO及其对照组细胞,结果显示,EPHA5诱导的细胞活力、细胞凋亡、干细胞标志物以及干细胞成球能力均可被FLI-06逆转。结论EPHA5在HER2阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药患者血样中的表达水平下调,且与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移状态及不良预后密切相关。EPHA5的缺失可以通过促进细胞增殖、减少细胞凋亡及增加DNA合成从而增强HER2阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性。EPHA5可以通过Notch1和PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌肿瘤干细胞干性发挥其影响曲妥珠单抗的敏感性的作用。本文研究结果提示,EPHA5有望成为逆转HER2阳性乳腺癌患者曲妥珠单抗耐药的新靶点。