论文部分内容阅读
光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)指特定波长光线激发光敏剂至激发态,后者衰减时将能量传递给周围氧气分子,产生活性氧,破坏周围生物大分子结构,最后导致细胞死亡。PDT主要用于浅表疾病治疗,如银屑病、黄斑病变、膀胱癌。第二代光敏剂多为酞菁类化合物,水溶性差,限制了其应用。本文采用纳米给药系统——聚合物胶束包裹光敏剂和化疗药物,依据增强渗透和滞留效应(EPR)将两种药物靶向输送至黑色素瘤,并由于pH敏感性,可较快释放药物到肿瘤组织,施加特定波长激光后,可激发光敏剂,同时产生光动力学和化疗作用,高效抑制肿瘤生长。本文采用实验室合成的pH敏感共聚物——甲氧基聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯-聚己内酯(mPEG-pDEA-PCL,PDP)和甲氧基聚乙二醇-聚甲基丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯(mPEG-pDEA,PD)作为基本材料分别构建了三嵌段聚合物胶束和二嵌段聚合物胶束,并包裹实验室合成的新型光敏剂——四羧基锌酞菁(zincβ-tetra-(4-carboxylbenzyloxyl)phthalocyanine,ZnPC4)和抗肿瘤药物紫杉醇。本文考察了ZnPC4的光物理学性质和生物学性(抗菌性能),以及包裹光敏剂和化疗药的pH敏感聚合物胶束抗黑色素瘤的体内外药效和体内靶向性。1.ZnPC4的光物理学性质用紫外可见分光光度法测定ZnPC4摩尔吸光系数,用荧光分光光度法测定ZnPC4的荧光量子产率,用单线态氧(1O2)捕捉分子探针9,10-二甲基蒽(DMA)间接测定ZnPC4的单线态氧量子产率。ZnPC4的N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液的最大吸收波长为680nm,最大激发波长616nm。采用660nm激光器激发,发现ZnPC4的单线态量子产率高于传统锌酞菁,而荧光量子产率低于锌酞菁,同时由于激发波长较大,可穿透较厚生物屏障,可成为高效光敏剂用于光动力学治疗。2.ZnPC4的光动力学抗菌性能将一定浓度的菌液与ZnPC4暗孵育一定时间,用660nm激光照射1次,采用平皿法铺板,分别考察ZnPC4对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和白色念珠菌(Candida albicans)的光动力学体外抗菌性能。ZnPC4对金黄色葡萄球菌具有明显的光动力学抑菌效果(Photodynamic antimicrobial therapy,PACT),同时暗毒性较小;对大肠杆菌的pact一般;对白色念珠菌的pact较好。本实验证明了znpc4具有明显的光动力学活性。3.载药ph敏感聚合物胶束的制备和性质分别用紫杉醇、znpc4或两者合用为模型药物,用四氢呋喃超声注入法制备载药pdp、pd聚合物胶束,挥去溶剂,得到均匀的胶束。透射电镜发现聚合物胶束为纳米级。用激光粒度仪测定了不同ph(4.5~8.0)下胶束的粒径和zeta电位,发现胶束的平均粒径和zeta电位呈ph依赖性,在弱酸性下粒径较大,电位为正电性,在中性和弱碱性下粒径较小,电位为负电性,非常有利于包裹药物和在肿瘤低ph条件下释放药物。以载药量和包封率为指标,筛选得到聚合物胶束的最优处方为:(1)三嵌段聚合物胶束,pdp/znpc4/ptx=5:1:1(w/w/w),紫杉醇包封率为55.60%,载药量为6.05%;(2)二嵌段聚合物胶束,pd:znpc4:ptx=5:1:0.5(w/w/w),紫杉醇的包封率为76.81%,载药量为2.89%。包封率和载药量均较高,可满足体内给药需求。4.紫杉醇和znpc4的含量测定方法建立高效液相色谱法测定紫杉醇的含量,进行方法学确证。建立紫外可见分光光度法测定znpc4的含量,进行方法学确证。5.载药ph敏感聚合物胶束的体外抗肿瘤药效选择人肝癌细胞株hepg2和小鼠黑色素瘤细胞株b16-f10作为模型,考察载药ph敏感聚合物胶束在细胞水平的光动力学效应。先将聚合物胶束和细胞暗孵育4h,然后用9j激光(660nm)照射60秒,培养24h后用mtt法检测细胞生存率,发现空白胶束对细胞的毒性很小,ptx和znpc4游离药物的抗肿瘤效果较差,而载ptx和znpc4的ph敏感聚合物胶束较游离药物的抗肿瘤效果有很大提升,说明pdp和pd聚合物是良好的药物载体。同时发现共载药胶束的药效强于单独载紫杉醇和znpc4的胶束,载znpc4聚合物胶束的暗毒性小,单独光照也不影响细胞生长。用分子生物学方法考察了载药聚合物胶束的药效机制,发现细胞首先吞噬胶束,照射后导致线粒体膜电位急剧降低,并引起细胞凋亡。实验还发现光动力学和化疗具有协同效应。本实验为体内抗肿瘤研究提供了依据。6.载药ph敏感聚合物胶束的体内抗肿瘤药效建立BALB/c裸鼠皮下黑色素瘤模型,小动物活体成像仪实时监测观察药物分布情况,发现在给药后4h后药物在肿瘤组织分布较多,4h时药物在瘤组织中的分布于心脏等组织。对黑色素瘤模型小鼠分组,静脉注射载药PDP聚合物胶束,每2日注射1次,共4次,期间观察动物状态,测量肿瘤体积和体重,第8日处死,肿瘤组织称重,计算抑瘤率,发现共载药胶束加光照组的药效强于单独载紫杉醇或ZnPC4的胶束,并有显著性差异;与阳性药(紫杉醇注射液)组药效相当,但阳性药的毒性强,并出现动物死亡。本文制备了载新型光敏剂和化疗药物的pH敏感聚合物胶束,考察了光动力学性质,并在体内外证明了其具有高效抗黑色素瘤效果,具有协同作用,并优于阳性对照药。该pH敏感聚合物胶束是一种有效的抗肿瘤靶向纳米载体。