论文部分内容阅读
目的：Wnt5a是一种分泌型糖蛋白，在机体的生长发育中发挥了重要作用，若表达异常会导致发育畸形和肿瘤发生。有研究表明：Wnt5a可以激活不同的信号通路发挥不同生理功能，如在肿瘤发生中既能发挥促癌因子的作用，也能发挥抑癌因子的作用。近年来，国外和我们的研究发现：Wnt5a在大多数白血病细胞中表达下调，导致了白血病细胞恶性增殖；我们还在治疗缓解的白血病病例中发现Wnt5a表达恢复；在髓系白血病U937细胞株中，外源性Wnt5a可下调β-catenin的表达，并阻滞细胞的有丝分裂进程，抑制了白血病细胞的恶性增值，但其机制尚不明确。本研究以髓系白血病细胞株U937为模型，采用免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光和RNA干扰等技术，研究Wnt5a在白血病细胞中发挥抑癌因子的作用机制。深入探讨：Wnt5a是否通过Ror2受体激活JNK/GSK-3β途径，促进β-catenin的磷酸化和降解，并下调其下游靶基因的表达，进而抑制细胞的恶性增殖；Wnt5a是否通过Ror2/JNK/GSK-3β途径调控中心体上β-catenin的表达和磷酸化，抑制中心体的分离，进而阻滞细胞有丝分裂的进程。该研究有利于从多方面揭示Wnt5a在白血病中发挥抑癌因子的作用机制，对深入认识白血病发病机理和不断提高白血病的诊疗水平均有重要研究价值。方法：1．Wnt5a对髓系白血病细胞中β-catenin表达和细胞增殖影响的研究1.1用RT-PCR、MSP(甲基化特异性PCR)检测髓系白血病骨髓标本中Wnt5a表达及其启动子的甲基化状态；分别用免疫细胞化学染色和Western blot检测病例骨髓细胞和U937细胞株中Wnt5a和β-catenin的表达。1.2用Western blot检测外源性Wnt5a处理U937细胞前后，β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1、C-myc的表达情况。1.3用双荧光素酶报告系统检测外源性Wnt5a处理U937细胞后，β-catenin的转录活性。1.4用MTT和流式细胞术检测外源性Wnt5a处理U937细胞后，细胞的增殖活力。2．U937细胞中Wnt5a通过Ror2途径下调β-catenin的机制研究2.1免疫组化检测急性髓系白血病和健康人骨髓有核细胞中Ror2和LRP5受体的表达情况。2.2用激光共聚焦显微镜检测U937细胞中Wnt5a、Ror2和LRP5的表达定位情况，用免疫沉淀法检测Wnt5a与Ror2、LRP5受体结合，用Western blot检测Ror2与LRP5受体表达的情况。2.3用Western blot检测相应抑制因素处理后（如：Ror2Ab、LiCl和SP600125）再以Wnt5a处理的U937细胞中JNK-p、GSK-3β-p、GSK-3β、β-catenin-p和β-catenin的表达。3．Wnt5a/Ror2通过非经典途径对中心体分离和细胞增殖的影响3.1用Western blot检测各种条件下（如：Ror2Ab和Ad-Si-β-catenin），Wnt5a处理的U937细胞中心体上β-catenin的表达。3.2用免疫荧光检测中心体上β-catenin的表达改变对中心体分离的影响。3.3用免疫荧光检测中心体上GSK-3β和β-catenin的分布与定位，用免疫沉淀法检测中心体上GSK-3β和β-catenin的结合情况，用Western blot检测在各种条件下（如：Ror2Ab、LiCl和SP600125）Wnt5a处理U937后，细胞中心体上β-catenin的磷酸化情况。3.4用激光共聚焦显微镜观察中心体上β-catenin的磷酸化对中心体分离的影响。结果：1．髓系白血病病例中，Wnt5a因其启动子甲基化而致表达下调，低表达Wnt5a的U937细胞株中β-catenin高表达。2．外源性Wnt5a通过下调U937细胞中β-catenin的表达，并抑制β-catenin/TCF4的转录活性，从而下调其靶基因Cyclin D1、C-myc的表达。3．外源性Wnt5a处理U937细胞后，可阻滞细胞的有丝分裂进程，抑制细胞恶性增殖。4．与健康人相比，急性髓系白血病病例骨髓有核细胞中Ror2受体表达较低，而LRP5受体表达较高。5．Wnt5a可上调U937细胞中Ror2受体的表达，并与Ror2受体结合的优势强于LRP5受体。6．Wnt5a与Ror2受体结合后，可激活JNK/GSK-3β非经典Wnt信号，下调U937细胞中总β-catenin和中心体上β-catenin表达，促进细胞中心体上β-catenin的磷酸化，并抑制中心体的分离。结论：在髓系白血病U937细胞株中，Wnt5a/Ror2/JNK/GSK-3β非经典Wnt信号途径通过影响经典Wnt信号核心分子——β-catenin的功能，发挥白血病抑制因子作用。如下调β-catenin蛋白表达，促进β-catenin磷酸化降解等，最终抑制细胞恶性增殖。主要有两方面：1.拮抗经典Wnt信号转导，抑制下游促进细胞增殖靶基因，如CyclinD1、C-myc等表达。2.影响细胞中心体的分离和纺锤体的形成，从而阻止细胞有丝分裂。