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流感是人类重要的传染病，全球每年约有20％的儿童和5％的成年人感染，给个人和社会带来非常大的负担。目前在人群中流行的主要有H1N1、H3N2亚型和乙型流感病毒，而H3N2亚型流感病毒自1968年引起世界流感大流行以来一直是人群中流行的一个主要亚型。接种流感疫苗是当前预防流感的主要措施，而目前的流感疫苗主要以流感病毒的膜蛋白血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)作为研究对象，而HA和NA均易发生变异，从而使流感疫苗的应用效果受到一定限制。
细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介导的特异性细胞免疫在机体抗病毒免疫中起着非常重要的作用，其中CTL表位通过结合感染细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)类分子，激发机体的细胞免疫水平，有助于病毒的清除与疾病的恢复，是构成防止病毒感染的第二道防线，是目前抗病毒免疫治疗的重要研究目标。而流感的NP蛋白和M蛋白由于序列高度保守，因此其抗原肽能够诱导产生针对同型(A型或B型)和异型病毒株的交叉免疫反应，是CTL反应的主要靶抗原，探索基于流感病毒NP和M蛋白的CTL表位对于开发新型疫苗有重要的意义。
传统的多肽表位筛选和鉴定方法(淋巴细胞功能试验)费时费力，通过生物信息学技术预测编码流感病毒的保守区段的00T细胞和B细胞表位，以及主要MHC分子结合肽，用质粒DNA作为载体或者直接合成表位抗原肽，在细胞因子或其他免疫佐剂的辅助下进行免疫，产生强的广谱的细胞免疫和体液免疫，由此产生能对同型病毒的同型保护和对异型病毒的交叉保护作用，有望解决流感病毒的频繁变异对于疫苗研制所造成的困难。
【目的】：
1.综合运用多种生物信息学软件，发现流感病毒H3N2内部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，并提高CTL表位预测的准确率，建立一种新的表位筛选模式。
2.通过实验验证前期预测的候选表位，发现新的H3N2内部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，为开发流感表位疫苗奠定基础。
【方法】：
1.通过T细胞表位预测、蛋白酶切位点预测、TAP预测、分子动力模拟对候选表位肽进行筛选，确定所要合成的流感病毒NP、M蛋白表位肽；
2.用芴甲氧羰基固相法合成前期预测的多肽，并进行亲和力、稳定性鉴定；
3.采用IFN-γ ELISPOT方法检测表位肽的CTL增殖活性，用51Cr释放实验分析细胞毒性分析各实验肽的CTL杀伤效应。
【结果】
1.生物信息学的预测结果表明，NP258-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等5个表位与HLA-A0201的结合情况比较理想，选择进入下游实验；
2.T2结合实验显示：候选肽NP258-266、NP48-56、M58-66的亲和力较高，F1值分别是2.06、1.73、1.99，而NP189-197、M3-11亲和力较低，F1值分别是0.72、0.23。稳定性结合实验显示：表位肽NP258-266、NP48—56、M58-66的半衰期分别为1.96h、2.14h、2.11h，均大于1h，表明稳定性较好，选择进入下游实验：
3.IFN-γ ELISPOT检测结果表明，NP258-266、NP48-56、M58-66每1×105个诱导的PBMC产生IFN-γ点数分别为746.3、612.1、665.3，说明我们所合成的几个表位肽具有较好的免疫原性，51Cr释放实验结果显示NP258-266、NP48-56、M58-66的特异性杀伤率分别为65.7％、60.4％、50.3％
【结论】
1.采用T细胞表位预测、蛋白酶切位点预测、TAP预测、分子动力模拟构成的表位筛选模式对流感病毒H3N2亚型NP蛋白、M蛋白的HLA—A0201限制性CTL表位进行预测：从预测结果中选取NP258-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等四个表位进行合成。
2.T2结合实验显示：候选肽NP258-266、NP48-56、M58-66的F1值均大于1.5，亲和力较高；稳定性结合实验显示：表位肽NP258-266、NP48-56、M58-66的半衰期分别均大于1h，表明稳定性较好。
3.酶联免疫斑点法(ELISPOT法)检测和51Cr杀伤实验检测候选肽体外刺激HLA-A0201 阳性的健康人PBMC所产生的效应细胞分泌的细胞因子和杀伤活性的结果显示：NP258-266、NP48-56、M58-66刺激PBMC可以产生较高的T细胞能特异性的杀伤靶细胞，并分泌较高水平的IFN-γ。
4.经JENPEP表位数据库查询，本实验所所发现的表位NP258-266、NP48-56、M58-66为新的流感病毒表位。