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研究背景类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的自身免疫性疾病,其发生发展与遗传、环境因素密切相关。研究表明类风湿性关节炎的严重程度受炎性介质的影响较大,主要的炎性介质有肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)以及白细胞介素-1(IL-1)等,其中TNF-α在RA的发病机制中起着非常重要的作用。当前,在类风湿性关节炎临床治疗中,针对TNF-α的药物如阿达木单抗,英夫利昔单抗等取得了很好的临床效果,不仅能够改善症状,还能够抑制关节的破坏。然而,这类抗TNF-α单抗药物因完全封闭了TNF-α的生物学功能,导致机体的免疫自稳、免疫监视功能受到影响,给患者带来了易发生结核病感染、产生新的自身免疫疾病甚至诱发肿瘤的风险。TNF-α在机体内的过量表达及TNF-α/TNFRs信号通路的异常激活与类风湿关节炎等自身免疫性疾病的发生发展有着密切关系。随着对RA发病机制的研究深入,当前更多的研究是把治疗的靶点转向TNFRs。然而,相对于TNF-α单抗等生物制剂,TNFRs的小分子拮抗剂的基础和应用研究进展缓慢。从抗炎角度来说,TNFR1主要传递促炎、凋亡信号,通过选择性地阻断TNFR1传递的信号通路来封闭TNF-α的生物学功能,已成为该类药物研发的热点。目前尚无一种具有高度选择性的TNFR1拮抗药物上市应用于临床。本课题组在前期工作的研究中,以TNF-α为靶点,生物淘选青环海蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库,获得了一条具有抗炎活性的海蛇蛇毒活性肽(Hydrostatin-SN1,22AA),以该活性肽Hydrostatin-SN1为前导肽,结构优化获得了一条抗炎活性肽(Hydrostatin-SN10,10AA),表面等离子共振技术(SPR)、微量热泳动技术(MST)结果表明,Hydrostatin-SN10能与TNFR1直接相互作用,且发现只与TNFR1结合,而不与TNFR2、TNF-α结合,靶点明确,具有选择性,并能够竞争性抑制TNFR1-TNF-α的相互作用,能够有效抑制TNF-α激活的细胞内NF-κB及MAPKs信号通路。本研究在类风湿性关节炎动物模型(CIA小鼠)上评价Hydrostatin-SN10及其PEG2000修饰后的PEG-SN10的体内抗炎效应,这将为研发Hydrostatin-SN10成为具有自主知识产权的、靶点明确的海洋生物来源新型选择性TNF-α受体抑制剂多肽药物奠定基础。研究目的通过建立胶原诱导的类风湿性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,研究Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的体内抗炎效应,为研发新型选择性TNF-α受体抑制剂多肽药物奠定基础。研究方法1、类风湿性关节炎模型的建立:于第0天取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积完全弗氏佐剂CFA(4mg/ml)涡旋混合,至滴于水上不分散为较好,实验组小鼠尾根部皮内注射100μl/只。第21天后加强免疫,取牛Ⅱ型胶原(4mg/ml)与等体积不完全弗氏佐剂IFA(4mg/ml)涡旋混合至滴于水上不分散为较好,小鼠尾根部皮内注射100μl/只。第29天观察造模成功,均分为正常组,模型组,Hydrostatin-SN10组,PEG-SN10组及英夫利昔单抗组(阳性对照组),当天开始腹腔注射给药,模型组及正常组腹腔注射PBS,Hydrostatin-SN10组腹腔注射Hydrostatin-SN10(1600μg/kg),PEG-SN10组腹腔注射PEG-SN10(1600μg/kg),英夫利昔单抗组腹腔注射英夫利昔单抗(4mg/kg),每日一次,连续给药24天,第53天处死小鼠。2、每天观察小鼠活动情况及毛发情况,每隔3天测定小鼠脚掌厚度并对脚掌进行关节炎指数评分,评价Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。3、ELISA试剂盒测定小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及炎症因子IL-17的表达量,运用流式检测试剂盒测定血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-10的表达量,从炎症因子表达水平观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。4、运用Micro-CT扫描观察小鼠后肢关节形态改变及骨质破坏程度,数据分析骨小梁的骨参数变化情况,从骨质破坏角度观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。5、采用流式测定脾脏中Treg细胞、辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)的表达情况,从免疫学角度观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。6、HE染色观察小鼠后肢关节损伤,滑膜炎及炎性细胞浸润等情况,免疫组化测定踝关节中TNF-α表达量及抗酒石酸磷酸酶染色观察破骨细胞的变化情况,从关节病理切片观察Hydrostatin-SN10及PEG-SN10的抗炎效果。研究结果1、正常小鼠精神状态良好,活动正常,毛色光亮而无脱毛现象;模型组小鼠加强免疫后,关节肿胀逐渐明显,精神状态欠佳,活动受到明显影响,无法正常活动,毛色无光泽且有脱毛现象;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组小鼠精神活动、毛色光泽、关节肿胀程度均较模型组明显减轻。Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能有效降低CIA小鼠的足爪肿胀程度及关节炎指数。2、血清中炎症因子测定结果表明:模型组小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17,TNF-α,IL-6,IFN-γ的含量显著高于正常组;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组可显著降低CIA小鼠血清中胶原特异性抗体IgG及促炎因子IL-17、TNF-α、IL-6、IFN-γ的含量,且能显著提高抑炎因子IL-10的表达水平。3、脾脏中Th细胞的测定结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组中Foxp3及IL-4的表达量均显著提高,而IL-17及IFN-γ的表达量显著降低。即Hydrostatin-SN10及PEG-SN10可能是通过调节Treg/Th17及Th1/Th2的变化发挥抗炎作用,从而抑制类风湿性关节炎的发生发展。4、小鼠后肢Micro-CT检查结果显示:正常组关节面光滑,关节结构清晰可见;模型组关节面粗糙,骨质破坏严重;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,骨质破坏程度明显减轻;小鼠骨小梁Micro-CT结果显示:正常组骨小梁结构完整;而模型组骨质破坏严重,有明显空洞;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,骨质破坏程度明显减轻;骨小梁的参数测定结果显示:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组骨密度(BMD)、骨体积/组织体积(BV/TV)、骨面积/组织体积(BS/TV)、小梁的数量(Th.N)、小梁厚度(Tb.Th)等参数显著上调,骨表面积/骨体积(BS/BV)、骨小梁的模式因子(Tb.pf)、小梁的分离度(Tb.sp)等参数显著下调。这些结果表明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10具有显著的抗炎效应。5、HE染色结果表明:正常组小鼠关节腔结构完整,未见软骨损伤,关节及滑膜组织中未见明显炎症细胞浸润;模型组可见关节结构破坏严重,丧失正常的关节结构,小鼠关节间隙消失,滑膜增生及软骨损伤严重,且可见严重的炎性细胞浸润;Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,可见关节结构完整,炎性细胞浸润明显减轻,关节损伤显著减弱。6、免疫组化结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组关节中TNF-α的表达量显著降低,抗炎效应显著。7、抗酒石酸磷酸酶染色结果表明:Hydrostatin-SN10组、PEG-SN10组及英夫利昔单抗组,抗酒石酸磷酸酶显著降低,即Hydrostatin-SN10及PEG-SN10能够减少破骨细胞的数量,从而减少对骨组织的侵蚀。结论本研究结果表明Hydrostatin-SN10及PEG-SN10在类风湿性关节炎动物模型(CIA小鼠)中具有显著的体内抗炎效应。