基于复合纳米材料构建超灵敏电致化学发光免疫传感器的研究

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电致化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)是通过施加一定的电压使电极产物之间或产物与体系中某组分进行化学反应而产生的一种光辐射。它是电化学方法和化学发光方法相结合的产物,现已成为一种广泛应用的高灵敏度和高选择性的检测方法。随着纳米材料迅速的发展,由于纳米材料具有独特的性质,如:大的比表面积、好的生物兼容性等,在生物传感器领域得到了广泛的应用。尤其是基于各种功能化复合纳米材料构建的ECL生物传感器在免疫分析领域有着重要的研究意义和实际的应用价值。本论文主要从以下几个方面开展研究工作:1.以脱铁铁蛋白为模板聚乙烯亚胺纳米颗粒为共反应试剂构建的信号放大型电致化学发光免疫传感器的研究本研究中,将脱铁铁蛋白独特的性质引入ECL检测,原位产生发光试剂的共反应试剂聚乙烯亚胺(PEI),同时结合碳纳米管(CNTs)大的比表面积和金纳米颗粒(AuNPs)的催化效率,进一步催化放大ECL发光信号,提高检测的灵敏度。首先制备了脱铁蛋白包裹的PEI纳米微球(Apo-PEI),并通过生物素-亲和素作用将Apo-PEI和二抗蛋白组装到碳纳米管表面制得bio-apo-PEI/SA/Ab2/CNTs二抗复合物。免疫传感器表面的修饰则是用Nafion分散石墨烯和碳纳米管,通过Nafion和Ru(bpy)32+的静电吸附固载Ru(bpy)32+,通过静电作用吸附纳米金,从而将抗体固定在电极表面。以人绒毛促性腺激素(HCG)为模型,通过夹心式免疫反应将制备的二抗复合物结合于电极表面,基于脱铁铁蛋白在pH2.0时可释放PEI从而原位产生共反应试剂放大响应信号,实现对HCG的灵敏检测。该免疫传感器线性范围宽(5.0×10-4~2.0×102mIU/mL)、检测限低(0.17μIU/mL)、选择性高、重现性好,在免疫测定领域有潜在的应用价值。2.基于磁性石墨烯标记的信号载体及聚赖氨酸为共反应试剂的无试剂型电致化学免疫传感器的研究本研究工作中,我们构建了一个磁性石墨烯作为Ru(bpy)32+和二抗的固载基质的无试剂型电致化学发光免疫传感器。敏感界面的构建是,首先在玻碳电极上电沉积聚赖氨酸膜,然后电沉积纳米金以固载总三碘甲状腺原氨酸抗体(anti-T3)。再以磁性石墨烯(Fe3O4@GO)负载Ru(bpy)32+和二抗蛋白作为信号放大探针。在此,聚赖氨酸含有许多伯氨基和仲氨基可作为Ru(bpy)32+的共反应试剂使得传感器呈现了较宽的线性范围(0.1pg/mL-10ng/mL)和相对较低的检测下限(0.03pg/mL)。该方法避免了将共反应试剂添加于测试底液中,显著简化了免疫测定过程,缩短了分析时间,为临床免疫测定法提供了新的参考。3.基于一种新型钉(Ⅱ)配合物自增强电致化学发光的超灵敏APE-1免疫传感器的研究在本工作中,我们合成了一种自增强的钌(Ⅱ)配合物并用于构建超灵敏的信号增强型免疫传感器实现了对脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE-1)抗原的检测。为了实现固载更多的自增强的钌(Ⅱ)配合物分子,我们将芳香族化合物3,4,9,10-花四甲酸(PTCA)结合到PEI-Ru(Ⅱ)中,使其可以然后通过π-π积作用组装到碳纳米管(CNTs)得到线团状的PTCA-PEI-Ru(Ⅱ)/CNTs复合材料。在利用PTCA-PEI-Ru(Ⅱ)/CNTs表面残留氨基进一步吸附空心纳米金(HGNPs),并以此标记二抗蛋白。ECL免疫传感界面的构建是通过电化学沉积金纳米粒子(AuNPs)在玻碳电极(GCE)上来固载捕获抗体(anti-APE-1)。基于夹心免疫模式检测APE-1抗原,该传感器显示出高的灵敏度,线性范围是1.0fg/mL~1.0pg/mL,检出限为0.3fg/mL(S/N=3)。该传感器具有很好稳定性,精确度和准确度,在临床诊断方面有较好的应用潜力。
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