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本研究首先发现狼山母鸡蛋白限饲导致子代胚胎发育迟缓,出雏重降低,同时种蛋中瘦素(leptin)沉积减少,卵黄膜上与激素信号传递相关的基因表达模式发生改变,因此推测1eptin可能作为一种母源性信号物质,通过改变卵黄膜、尿囊膜激素信号传递和血管形成相关基因的表达和尿囊膜血管的形成,影响鸡胚胎发育。为验证这一假说,我们分别在肉鸡和蛋鸡种蛋内注射leptin,观察其对不同品种的鸡胚重和出雏重的影响,同时检测卵黄膜和尿囊膜上相关基因的表达以及尿囊膜血管形成的变化；为进一步研究leptin对尿囊膜血管形成的影响,我们通过在尿囊膜上直接滴加leptin,以及在蛋鸡鸡胚尿囊膜上皮细胞体外培养体系中加入leptin,来深入研究leptin对尿囊膜血管形成相关基因及其蛋白表达的影响,为揭示母源性leptin影响禽类胚胎生长发育的机制提供实验证据。1狼山母鸡蛋白限饲对蛋内激素沉积和卵黄膜基因表达以及子代出雏重的影响选取44周龄狼山鸡种母鸡(扬州家禽研究所)120羽,随机分成两个组,对照组饲喂粗蛋白水平为15%的日粮,试验组(低蛋白组)饲喂粗蛋白水平为10%的日粮。收集种蛋,部分用于测定卵黄中leptin和皮质酮水平,其余在相同的标准条件下孵化,在14胚龄时各组选取10只鸡胚称重并采样,其余鸡胚继续孵化,记录出雏重。采用实时荧光RT-PCR定量卵黄膜、尿囊膜相关基因表达。结果显示：与对照组相比,低蛋白组母鸡种蛋中沉积的leptin含量显著减少(P<0.05),而皮质酮含量没有显著变化(P>0.05)；低蛋白组14胚龄胚重差异不显著(P>0.05),但出雏重显著低于对照组(P<0.05)；卵黄膜上与皮质酮代谢相关的酶20-羟类固醇脱氢酶(20-hydroxysteroid dehydrogenase,20HSD)及血管发生相关的碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, FGF2) mRNA表达显著下调(P<0.05),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA的表达明显下调(P=0.052),与瘦素转运相关的瘦素受体(leptin receptor, LepR)、甲状腺素转运相关的甲状腺素运载蛋白(transthyretin, TTR) mRNA的表达与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；尿囊膜上的20HSD、VEGF、FGF2、LepR mRNA表达也无显著变化(P>0.05)。以上结果提示：leptin可能作为种蛋中的信号物质改变胚膜相关基因的表达模式,影响鸡胚胎发育。2蛋内注射leptin对蛋鸡和肉鸡出雏重、尿囊膜血管形成以及胚外膜相关基因表达的影响为研究leptin对不同品种鸡胚胎发育和尿囊膜血管形成的影响,本实验分别将莱航蛋鸡和罗斯肉鸡种蛋随机分为两组,对照组于入孵前在蛋清内注射100μL溶剂(PBS),试验组注射相同体积的0.5 pg重组小鼠leptin。于12胚龄称重、测量胚长,同时采样用于mRNA的测定,出雏当天(0日龄)称重。在13胚龄时开窗,用等量的甲醇和丙酮固定尿囊膜,将尿囊膜置于显微镜下(×40)观察,随机选取相同面积的十个区域,观察拍照,用专业图象分析软件(Image-pro plus 4.5)计算血管的面积。结果显示,与对照组相比,leptin处理组蛋鸡和肉鸡12胚龄胚重、胚长和肉鸡的出雏重都无显著差异(P>0.05),但蛋鸡出雏重显著降低(P<0.05),且只表现在雌性；同时雌性蛋鸡的尿囊膜血管面积显著减少(P=0.037,P<0.05),而对雄性无显著影响；肉鸡不论性别尿囊膜血管面积都无显著变化(P>0.05)。与对照组相比,leptin处理显著上调雌性蛋鸡尿囊膜VEGF、LepR和20HSD的mRNA表达,FGF2 mRNA表达有上调趋势(P=0.071),而雄性尿囊膜只有20HSD mRNA表达显著上调(P<0.05)；雌性蛋鸡卵黄膜VEGF mRNA表达显著上调(P<0.05),雄性的基因表达均无显著变化(P>0.05)。与对照组相比,肉鸡尿囊膜LepR、20HSD、VEGF、FGF2 mRNA表达均无显著差异(P>0.05)；leptin处理显著上调了雄性肉鸡卵黄膜的LepR、VEGF mRNA表达,对20HSD、FGF2 mRNA表达无显著影响(P>0.05),雌性卵黄膜基因表达均无显著变化。以上结果提示：leptin对鸡胚发育、尿囊膜血管形成以及胚外膜基因表达的影响具有品种和性别特异性。蛋鸡尿囊膜基因表达模式的改变和血管生成的变化与蛋鸡出雏重降低相关联。3 Leptin对鸡胚尿囊膜血管形成的影响及其机制为了进一步研究leptin对鸡胚尿囊膜血管形成的影响,在7胚龄时给鸡胚开窗,第8天在开窗处尿囊膜上放置一个3～4mm直径的明胶海绵,上面分别滴加2.5μL含0、10、100 ng leptin的PBS溶液,2天后观察载体周围血管生成的数量变化情况。同时挑选12胚龄莱航蛋鸡鸡胚,分离尿囊膜,培养尿囊膜上皮细胞,分为四组：对照组(PBS)和leptin处理组(1 ng/mL、10ng/mL、100ng/mL)。每天换液给予leptin处理,于72 h收集细胞,提取细胞RNA和蛋白。实时荧光RT-PCR定量尿囊膜细胞上LepR、20HSD、VEGF、FGF2mRNA基因表达,用Western blot测定LepR、VEGF的蛋白含量。结果显示：与对照组相比,滴加10 ng leptin,蛋鸡尿囊膜中血管及血管总数明显减少(P=0.054,P=0.064),而小血管和大血管数无显著变化；雌性蛋鸡的中血管、大血管与血管总数均显著下降(P=0.011,P=0.014,P=0.044),对雄性来说不论大、中、小血管及血管总数均无显著变化；100 ng leptin处理蛋鸡尿囊膜和10 ng leptin处理肉鸡尿囊膜,不论性别,对各类血管均无显著影响。体外培养结果显示,三个剂量的1eptin处理24 h和48 h均不影响细胞的相对活性,但处理72 h显著抑制细胞的相对活性,并且浓度越高抑制效果越强,呈现明显的剂量效应。10、100 ng/mL leptin显著上调尿囊膜上皮细胞LepR mRNA表达(P<0.05),但LepR蛋白水平反而出现显著下降(10 ng/mL,P=0.029)或下降趋势(100 ng/mL,P=0.078)。三个剂量的1eptin处理均显著上调VEGF、FGF2 mRNA表达(P<0.05),但10和100 ng/mL leptin处理的细胞VEGF蛋白水平呈现下调的趋势(P=0.065,P=0.07)以上结果提示：胚胎期开窗直接给予10 ng leptin,主要影响雌性蛋鸡尿囊膜上血管的形成,其机制可能与leptin显著抑制体外培养的尿囊膜细胞的活性,降低VEGF蛋白水平有关。