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菜心是十字花科芸薹属白菜种的一种重要蔬菜,是华南地区栽培面积和上市量均最大的特产蔬菜。菜心是典型的菜薹类蔬菜,正常抽薹开花是其产品器官形成的必要条件。因此对菜心抽薹开花调控机制的研究历来受到关注。近年研究发现低温对菜心生长发育存在一定程度诱导作用,赤霉素对菜心的抽薹开花亦有促进作用。但有关温度和赤霉素在菜心抽薹开花调控方面的具体分子机制仍鲜有研究。DELLA蛋白是赤霉素信号转导通路中重要的负调控因子,在GA的调控途径中起着重要的作用。因此,本文基于实验室已有转录组数据库,通过基因克隆、生物信息学分析、石蜡切片、荧光定量PCR及酵母双杂的方法研究菜心DELLAs基因在菜心中的表达特性及对赤霉素和温度的响应特性。主要结果如下:1.利用一步克隆的方法克隆得到6个BcRGA1、BcRGA2、BcRGA2-like、BcRGL1、BcRGL2和BcRGL3基因,其基因的ORF全长分别为1722 bp、1740 bp、1740 bp、1524bp、1635 bp、1578 bp。系统进化树分析结果表明菜心DELLAs基因与白菜的同源性最高,与葡萄的亲缘关系最远。对菜心DELLAs基因编码氨基酸序列进行预测分析,并对这6个基因编码蛋白的结构域、保守模体等进行预测,发现其均具有典型的DELLA结构域和GRAS结构域,均属于DELLA家族基因。2.将BcRGA1、BcRGA2-like、BcRGL1、BcRGL2和BcRGL3基因连接到含绿色荧光蛋白的表达载体中构建融合表达载体,并在洋葱表皮中进行瞬时表达,结果表明BcRGA1、BcRGA2-like、BcRGL1、BcRGL2和BcRGL3基因都定位在细胞膜、细胞质和细胞核,只是信号的强弱不一样。BcRGA2定位在细胞膜和细胞核。3.利用荧光定量的方法检测菜心中6个DELLAs基因在不同时期不同部位的表达,结果表明BcRGA1、BcRGA2、BcRGA2-like、BcRGL1、BcRGL2和BcRGL3基因在菜心根、茎尖、叶片和花中均有表达。并且这几个基因在子叶期、三叶期、六叶期以及开花期表达模式相似,都是在茎和叶中的表达量最高。其中BcRGA1、BcRGA2-like、BcRGL1的表达量比其它3个基因要高。4.通过石蜡切片我们观察了油绿501和油青80天这两个品种的茎尖结构。从茎尖的纵切图可以看出,油绿501各个时期都比油青80天各个时期发育的要快,尤其是在四叶一心时期。两个品种在两叶一心时期,花芽分化都还未完成,而在四叶一心时期,油绿501的花芽分化已经完成。通过定量PCR我们发现,我们发现在两叶一心时,无论是叶片还是茎尖只有BcRGL1的表达量在两个品种之间有显著性差异,其它几个基因都没有显著性差异。在四叶一心时期,所有的基因的表达量均有差异。由此我们推测,BcRGL1可能在花芽分化中起重要的作用。5.为了研究赤霉素对菜心抽薹开花的影响,本文分别在两叶一心和三叶一心进行赤霉素喷施,结果表明两叶一心喷施GA3处理没有显著提前菜心抽薹开花,三叶一心喷施赤霉素显著提前了菜心抽薹开花。无论是两叶一心还是三叶一心烯效唑处理,都显著抑制了菜心抽薹开花。从基因表达量来看,两叶一心赤霉素处理会使DELLAs基因的表达上调,三叶一心赤霉素处理会使DELLAs基因的表达下调。6.为了研究菜心DELLAs基因是否受温度影响,我们用15℃低温处理二叶一心的菜心,定量结果表明15℃处理6 h,在菜心茎尖和叶片中DELLAs基因下调最为明显,但叶片中BcRGL2基因在处理6 h后并没有下调。7.为了验证菜心DELLA蛋白与赤霉素受体GID1之间的互作关系,我们采用了酵母双杂技术,酵母双杂的结果显示,只有GA存在时,6个DELLA蛋白才与GA受体BcGID1b互作;同时也发现6个DELLA蛋白都不与GA受体BcGID1a和BcGID1c互作。综上所述,本研究表明三叶一心喷施赤霉素使株高变高、茎粗变低、现蕾和开花率明显提高,用荧光定量检测DELLAs基因的表达量发现,除了BcRGL2,其它5个基因的表达量都显著下调,利用酵母双杂检测DELLA蛋白与赤霉素受体BcGID1的关系,发现DELLA蛋白能与BcGID1b互作,由此可推测,当赤霉素存在时,DELLA蛋白与赤霉素受体BcGID1b结合,形成疏水的表面,易于与E3泛素连接酶结合,使DELLA蛋白泛素化,从而被26S蛋白酶体降解,使菜心提前抽薹开花。