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绵羊瘤胃作为反刍动物的第一个胃,经常会受到各种病原微生物的挑战。绵羊瘤胃黏膜上皮在先天性免疫中发挥重要作用,并可以分泌一系列先天免疫分子来防止微生物的侵袭。防御素是一种由黏膜上皮产生并具有广谱抗微生物活性的阳离子肽,被认为是抗生素的潜在替代品。本课题组先前的研究表明酿酒酵母全细胞壁能够上调绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine ruminal epithelial cells,ORECs)内 β-防御素-1(Sheepβ-defensin-1,SBD-1)的表达,为了进一步确定酿酒酵母细胞壁诱导SBD-1表达的有效成分,本研究选用来源于酿酒酵母细胞壁的β-葡聚糖刺激ORECs以观察其对SBD-1表达的影响,并进一步研究此诱导过程可能涉及的信号通路。外植体培养具有在受控环境中保留与体内相似的组织学特征等特点,因此外植体培养相对于细胞而言更接近于体内环境。本研究探索了绵羊瘤胃外植体(Ovine ruminal explants,OREs)培养的可行性和最佳条件,并在此基础上研究β-葡聚糖对OREs内抗菌肽SBD-1、促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10表达的影响。具体研究内容及结果如下:(1)用不同浓度(0、5、10、20、50和100 μg/mL)的β-葡聚糖刺激ORECs 8 h后,利用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h),同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1表达的最佳时间。结果显示:10μg/mL的β-葡聚糖分别刺激ORECs 2和4 h时SBD-1 mRNA和蛋白表达最大。(2)采用Western blot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光、qPCR和ELISA方法检测β-葡聚糖诱导SBD-1表达上调的信号通路。结果表明树突状细胞相关C型凝集素 1(Dendritic-cell-associated C-type lectin 1,Dectin-1)和脾脏酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase,Syk)在绵羊瘤胃黏膜组织及ORECs内表达,并且用siRNAs干扰或抑制剂抑制Dectin-1、Syk、TLR-2和MyD88表达后减弱了β-葡聚糖诱导的SBD-1表达。用β-葡聚糖处理ORECs导致p38、JNK、ERK1/2和NF-κB表达显著增加,而用抑制剂抑制MAPK和NF-κB途径显著降低了 β-葡聚糖诱导SBD-1的表达,且NF-κB抑制剂效果最明显。(3)培养OREs,并采用H.E染色、qPCR和免疫组化等方法检测OREs的组织结构完整性及细胞活性。H.E染色结果显示:不添加血清的培养基内OREs组织结构更完整。qPCR和免疫组化结果显示:培养24 h以内的OREs E-cadherin的表达与未培养的组织差异不显著,且存在CK-18和Ki-67的阳性信号。(4)将OREs与不同浓度(0、10、50、100、200和400 μg/mL)的β-葡聚糖共培养8 h后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1、IL-6和IL-10的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h)后,同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达的最佳时间。结果显示:50 μg/mL的β-葡聚糖分别刺激OREs 2、8 和 12 h 时 SBD-1、IL-6 和 IL-10 的 mRNA 表达最高,100 pg/mL 的 β-葡聚糖刺激OREs 8 h时SBD-1蛋白表达达到峰值,而分别用50和200 μg/mL刺激OREs 12 h时IL-6和IL-10蛋白表达达到最大。本研究结果表明β-葡聚糖能够提高ORECs内SBD-1的表达,且该过程由Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-MAPK/NF-κB信号通路共同介导产生,但可能主要通过Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-NF-κB信号通路。此外,本研究还确定了 OREs体外培养的可行性和最佳条件,并证明β-葡聚糖可以激活OREs中SBD-1、IL-6和IL-10的分泌。