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绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis，OPA)是由D型绵羊肺腺瘤反转录病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）引起的是一种慢性、进行性、接触传染性肺脏肿瘤疾病。其在世界许多国家和地区均有发生，绵羊肺腺瘤病首次传入敏感羊群后发病率达50%-80%。成年绵羊易感且发病后继发感染性呼吸道疾病、生长缓慢、急剧消瘦，死亡率100%，严重影响着世界范围内养羊业的发展。本研究根据JSRV的gag基因，选取其保守序列片段作为检测目的片段，设计并合成相应的引物，以自然感染病例的肺脏肿瘤组织中所提取基因组DNA为模板，经PCR扩增得到目的基因片段，与GenBank公布gag基因序列进行比对分析，确定其保守序列后，设计引物及TaqMan荧光探针。将常规PCR产物连接入pMD18-T载体，经转化、提取质粒、定量，以10倍比连续稀释重组质粒pMD-gag，制成101-107copies/μl的阳性重组质粒标准品，取Ct值在23左右的重组质粒标准品为检测体系建立的阳性模板，对组分中各单因子浓度进行梯度优化实验逐步改变PCR反应体系各组分浓度，以确立体系各组分浓度。目的基因常规PCR扩增结果显示，所得目的基因条带长度为1843bp与Genebank公布的基因长度一致，相似性达99%。对其他几种羊易患病毒病、细菌病以及寄生虫病的核酸检测结果显示，仅阳性模板扩增出特异性的“S”型曲线，其他各检测样品核酸和阴性对照未见荧光信号增加，证明引物和探针对绵羊肺腺瘤病毒具有高度特异性；对连续稀释的阳性质粒标准品进行检测，所得Ct值经对数拟合成标准曲线，扩增方程为Y=-0.304X+38.4，相关系数R2=0.999，扩增效率为达到100%，40个循环实时荧光定量PCR最低可检出103copies/μl的样品。阳性质粒标准品在标准曲线上的数据点与曲线拟合良好。以重组质粒标准品10~5、10~4、10~3copies/μl为模板，进行检测体系的重复性实验，结果显示组内重复实验其变异系数在0.490-1.374%之间，组间重复性实验变异系数在0.120-0.826%之间，说明检测结果Ct值无显著性差异，离散程度很小，其范围均在统计学置信区间内，表明该检测体系稳定，具有良好的重复性。用建立的JSRV实时荧光定量PCR检测方法对11个地区羊的羊肺样品进行检测。根据Ct数据值在20-30范围可信区间内，定义为阳性。检测结果表明，在来自澳大利亚样品以及萝北、鸡东、佳木斯样品中，检测结果均为阴性；检测的内蒙古样品阳性率45%；齐齐哈尔羊肺样阳性率37%；肇东样品阳性率80%；兰西样品阳性率20%；牡丹江样品阳性率40%；尚志样品阳性率20%；嫩江样品全部为阳性。由检测结果可初步看出，澳大利亚、萝北、鸡东和佳木斯目前无绵羊肺腺瘤病毒感染。本实验采用所检测样品编号与竞争性ELISA一致编号进行，对比结果表明，RT-PCR检测到内蒙古样品阳性数比ELISA检测结果多3个，分别为8、41和57号样品，阳性率为50%；齐齐哈尔样品阳性数比ELISA检测结果多2个，分别编号为33和46号样品，阳性率为46%；肇东样品阳性数比ELISA检测结果多1个，编号为4号样品，阳性率为80%。并且，以上存在差异的样品在RT-PCR扩增曲线上看，“S”型曲线光滑，起峰位置较早，所以可排除假阳性的可能，因此，通过以上诸多样品的检测可判定RT-PCR检测比竞争性ELISA方法检出率略高，敏感性也稍高，准确性也较好。本研究利用实时荧光定量PCR技术，建立了绵羊肺腺瘤病的检测方法，为该病的检测以及以后制作试剂盒提供良好的实用技术和研究基础。