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鱼类肠道中存在丰富的菌群，它们通过分泌酶类和产生活性物质参与宿主的生命活动，与机体的免疫和营养密切相关。本实验采用高通量测序技术(high-throughput sequencing)中的454焦磷酸测序技术(454 pyrosequencing)分析分别摄食配合饲料或冰鲜鱼的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）幼鱼肠道壁和肠道内容物中的菌群;采用传统培养法筛选分离出大黄鱼幼鱼肠道内容物菌群，基于培养分离的幼鱼肠道内容物的菌株，采用Fusion primer and nested integratedPCR(FPNI-PCR)方法从柠檬酸杆菌P（Citrobacter sp.P）克隆出几丁质酶基因chi-X，并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中表达，探讨该酶的性质;测定假单胞菌X(Pseudomonas sp.X)分泌脂肪酶能力，采用FPNI-PCR克隆出脂肪酶基因lipase-X，构建大肠杆菌表达体系。得到结果和结论如下:
1.摄食不同食物的大黄鱼幼鱼肠道壁及其内容物菌群多样性分析
454焦磷酸测序结果表明，大黄鱼幼鱼肠道内容物及肠道壁中变形菌门(Proteobacteria)为主要优势菌，其次是梭杆菌门(Fusobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)。
基于16S rRNA V3区454焦磷酸测序结果的聚类分析显示:摄食配合饲料和冰鲜鱼的大黄鱼幼鱼肠道内容物及其肠道壁中的菌群差异明显。相同处理组的大黄鱼幼鱼肠道内容物和肠道壁的菌群相似。基于16S rRNA V6区454焦磷酸测序结果的聚类分析显示:摄食配合饲料大黄鱼幼鱼肠道内容物和肠道壁菌群较相似，摄食冰鲜鱼幼鱼肠道内容物与肠道壁菌群差异较大。主成分分析结果发现，食物种类是主要影响因子。
2.摄食冰鲜鱼的大黄鱼幼鱼肠道内容物菌群的培养分离
采用传统培养法共鉴定出17种细菌及6种真菌，分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（En tero ba cter）、寡单胞菌属（Stenotrophomonas）、迪茨菌属（Dietzia）、摩根氏菌属（Morganella）、假单胞菌属（Pseudomonas）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢菌属（Cladosporium）、红酵母属（Rhodotorula）、菌绒孢属（Mycovellosiella）、青霉菌属（Penicillium）及大单孢属(Aplosporella)。
3.大黄鱼幼鱼肠道内容物中柠檬酸杆菌P的几丁质酶基因chi-X的克隆及表达
采用FPNI-PCR从柠檬酸杆菌P克隆出几丁质酶基因chi-X，在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中成功表达，并测定该酶的性质。chi-X基因登录号为GenBank KC290945。根据预测结果，chi-X编码的氨基酸序列含493个残基及几丁质酶18家族催化域，与其他几丁质酶基因相似性低于63％。重组蛋白CHI-X经镍柱层析后得以纯化。以胶体几丁质为底物时，纯化蛋白CHI-X最适反应pH为4.0，pH3.0-8.0时其相对酶活大于60％;最适反应温度为60℃;在pH3.0-11.0范围内，温度低于60℃时保存稳定;其比活为137.65 U/mg蛋白;Km和Vmax值分别为6.24 mg/mL和2.49μtmol/min; Mn2+促进其酶活、Ag+抑制其酶活;具有抗蛋白酶性质;酶解产物为N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N，N-二乙酰壳二糖(GlcNAc2)。CHI-X能降解胶体几丁质和虾壳几丁质。
4.大黄鱼幼鱼肠道内容物中假单胞菌X产脂肪酶能力及脂肪酶基因的克隆
采用对硝基苯酚法(pNP method)，以4-硝基苯基癸酯为底物，测定脂肪酶酶活。假单胞菌X在LB液体培养基中产胞外脂肪酶量为2.99 U/L。采用FPNI-PCR从假单胞菌X中克隆出脂肪酶基因lipase-X，并成功构建了其大肠杆菌表达体系，初步鉴定重组蛋白Lipase-X的表达量为5 U/L。lipase-X长度为834bp。据预测，lipase-X可能含α/β水解酶1家族（α/βhydrolase-1），α/β水解酶3家族，水解酶4家族(Hydrolase-4)及未知功能的DUF1057结构域。