原发性肝癌（primary liver cancer,PLC）是全球最常见的恶性肿瘤之一,在所有癌症中,发病率居第六位,死亡率居第四位,其中男性发病率居第五位,死亡率居第二位。根据我国对恶性肿瘤发病和死亡的最新统计,肝癌年新发病例和死亡病例分别为37万和32.6万,分别位居第四和第二,其中男性发病率居第三位,死亡率高居第二位。乙肝病毒（Hepatitis virus B,HBV）感染导致的肝纤维化和肝硬化是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）最主要的危险因素,我国80%以上的肝癌患者都有乙肝病史,HBV感染是原发性肝癌的最主要病因。我国乙型病毒性肝炎发病人口数量庞大,乙肝相关肝癌发病人数长期以来仍居高不下,早期诊断率低于30%,尽管手术切除可大大改善患者预后,但肝癌总体5年生存率依然很低,且提升速度相当缓慢,近年来仅由10.1%提高到12.1%。早期诊断、早期干预治疗被认为是患者获得长期生存的最主要途径,而早期诊断需要有效的HCC筛查和监测手段,特别是对高危人群,如对慢性乙型肝炎以及肝硬化患者进行定期有效的监测,有效提高早期HCC的检出率,降低HBV感染为主要病因肝癌的死亡率。肝脏穿刺后病理检查是目前诊断肝癌的金标准,但有创穿刺对病人创伤及相关风险较大,不能被患者普遍接受。影像学检查（如MRI、CT等）对肝癌诊断有较高价值,可为肝癌患者的诊断提供帮助,并可显示血管侵犯、反映患者肝脏血流情况,但存在检查费用高以及检查前预约等待时间长、结果判读需要经验等问题。现阶段许多指南均建议使用血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）和肝脏超声检查作为筛查HCC的主要工具。肝脏超声是临床最常规的影像学检查方法,优点是成本低、易操作、移动便携,但对于早期小肝癌的检出率受限。血清AFP长期以来一直被认为是辅助诊断价值较高的HCC血清标志物,对HCC的早期辅助诊断、疗效评估、复发监测、预后判断等均具有重要的临床应用价值,但假阳性和假阴性情况的出现会影响临床辅助诊断的准确性,大约有30%-40%的肝癌患者AFP水平正常,AFP敏感性和特异性不足的缺陷可造成HCC的漏诊和误诊。临床辅助诊断HCC仍然迫切需要其他血清标志物的加入,以及依托大数据的多参数辅助诊断模型来提高HCC的监测效率。临床上理想的肝癌辅助诊断标志物需要具备较高的敏感性,能够辅助早期诊断。还需尽可能提高诊断特异性,且易于进行重复动态检测。同时也应能够显示肿瘤的生物学状态、肝癌分期和监测治疗效果。除了AFP,部分肝癌诊断指南中也提到了其他一些肝癌血清标志物,主要包括:甲胎蛋白异质体（lectin-bound alpha-fetoprotein,AFP-L3）、异常凝血酶原（des-gamma carboxyprothrombin,DCP,也称PIVKA-II）、a-岩藻糖苷酶（a-fucosidase,AFU）、7种微小核糖核酸（seven micro RNAs）等。随着蛋白质组学、基因组学、转录组学等的不断发展,越来越多的血清标志物应用于临床。在精准医学时代,随着大数据、人工智能在医学中的发展,越来越多的模型被临床用于HCC的早期辅助诊断和病程管理,例如本研究中运用临床常用指标建立的HCC的辅助诊断和MVI预测模型就是提高辅助诊断效能的有效方法。第一部分GALAD模型对原发性肝细胞癌辅助诊断及微血管侵犯预测的临床验证GALAD模型是20 14年J ohns on基于临床多个参数建立、20 1 6年B er ha n e基于多个国际队列验证的HCC辅助诊断模型,涉及参数包括性别（G）、年龄（A）以及三项血清标志物甲胎蛋白（A）、甲胎蛋白异质体（L）、异常凝血酶原（D）,GALAD模型能提高HCC辅助诊断的敏感性,特别是早期HCC检出率,并且能够补充超声筛查的不足。目前MVI的预测主要是通过手术后组织样本病理形态学检测实现,无法实现术前预测,有学者提出用DCP预测MVI的发生,而DCP作为重要权重参数的统计模型GALAD用于MVI的预测还未被提出。本部分研究主要探讨GALAD模型对HCC的辅助诊断以及对微血管侵犯（MVI）的预测价值。采用回顾性研究方法,纳入本院接受根治性手术治疗的原发性肝细胞癌（HCC）患者5919例为实验组,同期良性肝脏疾病（BLDs）1745例为对照组。验证结果显示,与单个血清标志物比较,GALAD模型对原发性肝细胞癌的辅助诊断价值更高,以-0.33为最佳截断值,其敏感性、特异性和准确性分别为91.9%、86.8%和90.7%,曲线下面积高达0.960[95%CI（0.955-0.964）]。对于直径≤5cm的肿瘤,模型也有较高的辅助诊断价值,尤其在辅助诊断直径≤2cm的肝癌时,GALAD模型鉴别HCC与BLDs曲线下面积也可达到0.850[95%CI（0.832-0.869）]。与未发现MVI（M0）相比,MVI低危组（M1）、MVI高危组（M2）、发现MVI组（M1+2）的GALAD模型值均显著升高。模型区分M0与M1+2的曲线下面积为0.663[95%CI（0.649-0.677）],显著高于DCP的曲线下面积0.635[95%CI（0.621-0.649）],GALAD模型预测MVI高危组（M2）曲线下面积达0.717[95%CI（0.701-0.733）]。研究结果表明GALAD模型用于原发性肝细胞癌的辅助诊断比单个血清标志物性能更佳,并对MVI有一定的临床预测价值。第二部分原发性肝癌辅助诊断模型的建立及应用第一部分中验证的GALAD辅助诊断模型的建立并未聚焦在乙型肝炎病毒（HBV）相关的HCC,而我国80%以上的肝癌与HBV感染有关,且用于肝癌鉴别诊断的部分特殊指标,例如AFP-L3、DCP等,在许多医疗机构及体检人群中无法常规开展。因此在本研究中,我们尝试建立基于多维度临床实验室数据的HCC辅助诊断模型,用于区分肝癌和良性肝脏疾病（特殊模型）以及肝癌与非肝癌（基础模型）,并用多中心数据验证所建立模型的辅助诊断效能。2015年至2019年间,招募5家医院共16516名受试者,包括肝癌和非肝癌对照组。对临床上50个维度的数据,采用二元Logistic回归分析,先用单因素分析对自变量进行初步筛选,对有意义的自变量再逐步做多因素的Logistic回归分析,通过逐步回归确定独立危险因素,构建相应的Logistic回归模型,最终共建立三个特殊辅助诊断模型LAD、C-GALAD、GAPTALAD,分别对其敏感性、特异性和准确性进行评估,并在验证队列中对模型效能进行验证。在训练队列和验证队列中,三个辅助诊断模型的ROC曲线下面积均大于0.9,其中GAPTALAD模型可高达0.973。进一步分析常规体检指标与肝癌发生相关的危险因素,最终得出性别、年龄、NEU、PLT、TBIL、ALB以及lg AFP与肝癌相关,建立GATANAP模型并绘制列线图。在训练队列和验证队列中,GATANAP模型对鉴别HCC与non-HCC患者的ROC曲线下面积分别为0.917[95%CI（0.912-0.922）]和0.931[95%CI（0.923-0.939）]。而AFP在训练队列和验证队列中鉴别HCC和non-HCC患者的ROC曲线下面积分别为0.864[95%CI（0.858-0.871）]和0.835[95%CI（0.822-0.849）],结果显示模型的辅助诊断效能显著高于AFP。在训练队列中,GATANAP模型区分AFP阴性（<20ng/ml）肝癌和良性肝病（BLDs）的敏感性、特异性和曲线下面积（AUC）分别为53.8%、87.9%和0.830[95%CI（0.821-0.840）],并在验证队列中进行验证。在纵向随访队列中,高危组患者（29.58±13.16月）在肝切除术后的OS时间比低风险患者（31.15±12.69月）短,同时高危组患者RFS也较差,结果显示GATANAP模型对肝癌具有潜在的预后价值。GATANAP模型辅助诊断HCC在外部验证集的符合性均大于70%,最高可达91.7%。GATANAP模型的参数均为常规体检指标,对于常规体检人群以及一些不能常规开展肝癌三联检的医疗机构,此模型适用性很强。三个特殊模型,均包含肝癌三联检指标（AFP-L3、AFP和DCP）,模型参数最多的GAPTALAD模型诊断效率最高,参数最少的LAD模型,使用起来最方便。各使用单位可根据自身条件以及信息整合能力,根据需要选择合适的模型。第三部分原发性肝癌MVI预测模型的建立及应用微血管侵犯（microvascular invasion,MVI）是肝癌具有侵袭性生物学行为的标志,对肝癌预后具有重要预测价值,是临床上肝癌术后复发的重要病理指征。前面尝试用GALAD模型对HCC患者是否发生MVI进行了预测,但预测效率不够理想,本部分尝试采用实验室数据建立多参数模型预测HCC患者是否发生MVI。纳入本院2015年至2017年5602例HCC患者作为训练队列,2018年1905例HCC患者作为验证队列。统计性别、年龄及术前48个维度数据的检测结果。在训练队列中,采用Logistic回归分析评估HCC患者术前发生MVI的危险因素,依此建立预测模型,PA-SALAD=0.220-0.002×PLT-0.019×Age+0.016×SA-0.029×Alb+0.012×AFP-L3+0.204×lg AFP+0.308×lg DCP,并在验证队列中进行独立验证。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估PA-SALAD模型预测HCC患者发生MVI的效能,以-0.2353为最佳截断值,在训练队列中,PA-SALAD模型预测有MVI的曲线下面积为0.695,在验证队列中,采用相同的截断值,模型预测有MVI的曲线下面积为0.704,在鉴别M0与M2时,曲线下面积可达0.752。由此可见,利用临床检验数据建立微血管侵犯预测模型可以较好的预测微血管侵犯的发生,特别是对高危MVI有较高的预测价值。本部分对微血管侵犯发生的风险进行分层,为肝癌伴随微血管侵犯患者的个体化治疗提供了依据。第四部分DCP在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞功能的影响前面三部分临床大数据研究提示DCP是HCC辅助诊断及MVI预测重要的权重指标,故本部分进一步对DCP蛋白水平及体外细胞功能进行研究,主要研究DCP在肝癌组织中的表达,通过免疫印迹（Western Blot,WB）实验分析癌栓组织、肝癌组织和配对癌旁组织中DCP的表达,为DCP检测在HCC患者临床应用中的价值提供依据,共分析10对HCC患者癌栓组织、肝癌组织和癌旁组织DCP蛋白相对内参表达量的差异,结果显示三者相互之间均未见显著差异（P>0.05）。我们将手术切除并经病理明确诊断的90对肝癌和配对癌旁组织制成组织芯片,对组织芯片进行染色,ZEISS显微镜扫描芯片并生成扫描图片,配对分析组织芯片免疫组化染色结果,判读每个组织样本染色强度和阳性率,染色指数定义为染色强度×阳性率,研究结果显示肝癌组织染色指数为0.05（0.03,0.08）,癌旁组织为0.08（0.05,0.11）,癌旁组织DCP染色指数显著高于肝癌组织（P<0.001）。肝癌组织中DCP-IHC（-）患者血清lg DCP的值为2.22（1.80,2.64）,DCP-IHC（+）患者血清lg DCP的值为3.27（2.90,3.65）,肝癌组织DCP-IHC（+）患者lg DCP的值显著高于DCP-IHC（-）患者（P<0.001）。癌旁组织DCP-IHC（-）患者血清lg DCP的值为2.67（2.12,3.22）,DCP-IHC（+）患者血清lg DCP的值为3.10（2.71,3.50）,癌旁组织DCP-IHC（+）患者lg DCP的值也显著高于DCP-IHC（-）患者（P<0.001）。为进一步探讨DCP在肝癌发生发展过程中的作用,我们分析了肝癌组织和癌旁组织DCP染色指数与病理特征的关系,发现DCP染色指数在有无包膜、有无血管侵犯、有无门脉癌栓、不同肿瘤大小、有无卫星灶、有无邻近器官侵犯、TNM分期、Edmondson分级之间均无差异。对其中68例HCC患者进行术后跟踪随访,随访时间为46.7±35.9月,结果显示,肝癌组织DCP-IHC（+）与DCP-IHC（-）、癌旁组织DCP-IHC（+）与DCP-IHC（-）、血液DCP阴性与阳性患者之间生存率均无差异（P>0.05）。进一步细胞功能研究提示,DCP对Hep G2和PLC/PRF/5细胞的迁移有促进作用,并可促进Hep G2和PLC/PRF/5细胞的增殖。孵育72小时,Hep G2细胞划痕愈合率从50.5%增加到78%,PLC/PRF/5细胞划痕愈合率从45%增加到78%。DCP促进Hep G2细胞增殖生长,在48H时增殖率达到平台期,在不同DCP刺激浓度（5-320 m AU/m L）时,显示存在量效关系,增殖率分别为40.0%、70.5%、92.4%、106.0%、116.2%、134.3%、148.1%。DCP同样也能促进PLC/PRF/5细胞增殖生长,在96H时增殖率达到平台期,在不同DCP刺激浓度（5-320 m AU/m L）时,增殖率分别为32.9%、46.9%、63.6%、74.2%、87.4%、96.2%、117.9%,同样存在量效关系。综上,本研究首先对GALAD模型对HCC的辅助诊断进行验证,并尝试分析GALAD模型对MVI的预测价值。在以上工作基础上我们根据国人HCC病因特征自建了肝癌辅助诊断和MVI预测模型,发现我们的自建模型可大大提高肝癌的辅助诊断及对MVI的预测效能,适合于选择不同检测指标的现实场景。临床大数据研究提示DCP是HCC辅助诊断及MVI预测重要的权重指标,进一步对DCP蛋白水平及体外细胞功能进行研究,发现DCP在体外具有促进肝癌细胞增殖和迁移的作用。