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梨小食心虫GrapholitamolestaBusck是一种世界性害虫,严重危害仁果类和核果类果树。第1代和第2代幼虫危害桃树、油桃和李树等果树的幼芽,之后转移至梨园和苹果园进行为害,第3代和第4代幼虫主要以果肉为食,具有典型的季节性转移寄主危害习性。有研究发现,寄主植物挥发物组分的变化是引起这一现象的重要原因之一。梨小食心虫可以通过敏锐的嗅觉系统感知寄主植物释放的挥发物成分来识别寄主。梨小食心虫嗅觉相关基因研究主要集中在性信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)、气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)和气味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)等,而对普通气味受体(odorant receptors,ORs)的研究较少。鉴于此,本研究通过梨小食心虫雌虫触角转录组数据,克隆获得5个GmolORs基因并对其序列和结构特征进行分析,利用实时荧光定量PCR技术分析GmolORs基因在不同发育时期(卵、幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足、翅)和雌成虫不同日龄触角(1、3、5和7日龄)中的表达谱,应用爪蟾卵母细胞表达系统和RNA干扰技术,研究GmolORs的功能并进行验证,主要结果如下:
1.以梨小食心虫触角转录组数据为基础,获得的5个GmolORs基因,GmolOR7(MH844555 )、GmolOR9(MK548580 )、GmolOR12(MK910370 )、GmolOR20(MH898864)和GmolOR21(MH898865),分别具有8、7、7、7、5个跨膜结构域,具有ORs典型的结构特征。多序列比对和系统进化树分析表明,5个GmolORs基因相互之间的同源性较低,只有31.26%;5个GmolORs聚类到5个不同ORs分支,说明它们在进化上高度分化。
2.实时荧光定量PCR结果表明,不同发育时期比较:GmolOR7、GmolOR9、GmolOR12、GmolOR20和GmolOR21在各发育期均有表达,但以成虫期的表达量均显著高于其他发育期(P<0.05);成虫不同组织部位比较:GmolORs基因均主要在成虫触角中表达,尤以雌虫触角中的表达量极显著高于雄虫(P<0.01),在成虫其他组织中少量表达甚至不表达,据此推测,GmolORs在梨小食心虫整个发育过程中,可能或多或少地均参与了寄主植物挥发物的识别。不同日龄雌成虫触角比较:GmolORs基因在不同日龄雌成虫触角中均有表达,且以3日龄时表达量最高,推测GmolORs在宿主-植物定位和产卵地点选择等方面可能发挥重要作用。
3.爪蟾卵母细胞表达系统结果显示,GmolOR9对供试47种气味组分中的8种寄主植物挥发物组分有反应,分别为酯类(顺-3-己烯乙酸酯、庚酸乙酯、丙酸丁酯和己酸乙酯)和醇类(芳樟醇、顺-3-己烯醇、正己醇和异辛醇);其中,异辛醇的反应显著高于其他气味组分。GmolOR12分别对醇类(癸醇)和醛类(庚醛、辛醛、壬醛和癸醛)寄主植物挥发物组分有反应;其中,壬醛的反应显著高于其他气味组分。GmolOR20和GmolOR21对供试的性信息素组分以及寄主植物挥发物组分均无反应,说明它们可能对本研究以外的气味组分有反应。
4.利用RNA干扰技术结合触角电位试验研究GmolOR7和GmolOR9的功能发现,注射dsOR7后,GmolOR7在雌雄虫中的表达量和雌虫对乙酸丁酯的EAG反应与对照组相比均显著降低(P<0.05)。与对照组相比,注射dsOR9的雌雄虫中GmolOR9的表达量和雌虫对顺-3-己烯乙酸酯的EAG反应显著降低(P<0.05)。据此证实,GmolOR7和GmolOR9分别参与了对乙酸丁酯和顺-3-己烯乙酸酯的识别。
1.以梨小食心虫触角转录组数据为基础,获得的5个GmolORs基因,GmolOR7(MH844555 )、GmolOR9(MK548580 )、GmolOR12(MK910370 )、GmolOR20(MH898864)和GmolOR21(MH898865),分别具有8、7、7、7、5个跨膜结构域,具有ORs典型的结构特征。多序列比对和系统进化树分析表明,5个GmolORs基因相互之间的同源性较低,只有31.26%;5个GmolORs聚类到5个不同ORs分支,说明它们在进化上高度分化。
2.实时荧光定量PCR结果表明,不同发育时期比较:GmolOR7、GmolOR9、GmolOR12、GmolOR20和GmolOR21在各发育期均有表达,但以成虫期的表达量均显著高于其他发育期(P<0.05);成虫不同组织部位比较:GmolORs基因均主要在成虫触角中表达,尤以雌虫触角中的表达量极显著高于雄虫(P<0.01),在成虫其他组织中少量表达甚至不表达,据此推测,GmolORs在梨小食心虫整个发育过程中,可能或多或少地均参与了寄主植物挥发物的识别。不同日龄雌成虫触角比较:GmolORs基因在不同日龄雌成虫触角中均有表达,且以3日龄时表达量最高,推测GmolORs在宿主-植物定位和产卵地点选择等方面可能发挥重要作用。
3.爪蟾卵母细胞表达系统结果显示,GmolOR9对供试47种气味组分中的8种寄主植物挥发物组分有反应,分别为酯类(顺-3-己烯乙酸酯、庚酸乙酯、丙酸丁酯和己酸乙酯)和醇类(芳樟醇、顺-3-己烯醇、正己醇和异辛醇);其中,异辛醇的反应显著高于其他气味组分。GmolOR12分别对醇类(癸醇)和醛类(庚醛、辛醛、壬醛和癸醛)寄主植物挥发物组分有反应;其中,壬醛的反应显著高于其他气味组分。GmolOR20和GmolOR21对供试的性信息素组分以及寄主植物挥发物组分均无反应,说明它们可能对本研究以外的气味组分有反应。
4.利用RNA干扰技术结合触角电位试验研究GmolOR7和GmolOR9的功能发现,注射dsOR7后,GmolOR7在雌雄虫中的表达量和雌虫对乙酸丁酯的EAG反应与对照组相比均显著降低(P<0.05)。与对照组相比,注射dsOR9的雌雄虫中GmolOR9的表达量和雌虫对顺-3-己烯乙酸酯的EAG反应显著降低(P<0.05)。据此证实,GmolOR7和GmolOR9分别参与了对乙酸丁酯和顺-3-己烯乙酸酯的识别。