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目的:为解决组织工程骨血管化缓慢,新骨生长迟缓等问题,在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞,而且同时植入加速血管形成的内皮细胞。血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells,VECs)可以有力的支持脂肪干细胞(Adipose-Derived Stromal Cells,ADSCs)向成骨方向转变,还可以加快血管的发生为干细胞的成骨提供营养支持。有血管内皮细胞参与的联合培养的骨组织工程种子细胞越来越成为有希望在临床上应用。本实验研究在体、外情况下,在联合培养体系中血管内皮细胞对脂肪干细胞的增殖、成骨分化的影响;确定联合培养ADSCs和VECs作为种子细胞的生物工程骨修复骨缺损能力。方法:(1)分离大鼠脐血单个核细胞,血管内皮诱导液培养分化,于3周、6周进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF表面标志。(2)用4种不同类型的血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CDl33、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14天进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性。(3)取脂肪干细胞与脐血源血管内皮细胞按照血管内皮细胞、3:1、1:3、1:1、脂肪干细胞的浓度共同培养;分别倒置显微镜下观察联合细胞的形态变化;MTT法描出各浓度细胞的生长曲线,比较各组细胞生长曲线差异;7、14天各组ALP试剂盒测定细胞内碱性磷酸酶活性和饱和茜素红钙染色;倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙分泌情况;4、7、14天定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量。(4)用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,扫描电镜观察;脂肪干细胞和血管内皮细胞接种部分脱蛋白骨和部分脱蛋白生物骨片,MTT法检测吸光度,评价纤维粘连蛋白脂肪干细胞在PDPB生长影响及三种不同细胞组在PDPBB生长情况,分析移植最佳时机,扫描电镜观察不同细胞组在PDPBB生长情况。(5)分别用BrdU标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,植于SD大鼠两侧股部肌袋处;流式细胞仪检测外周血CD3、CD4、CD8因子情况,根据CD4/CD8分析外周血T淋巴亚群情况来分析机体植入组织工程骨的免疫排斥情况;硬组织切片计算比较新骨成骨量;硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况。(6)取健康SD大鼠60只,随机分为5组(A组:PDPBB+血管内皮细胞组;B组;PDPBB+脂肪干细胞组;C组:PDPBB+1:1联合培养细胞组;D组:单纯PDPBB组:E组:空白组),在下颌骨体部椎板咬骨钳制造0.5×0.4临界骨缺损,分别将组织工程骨植于SD大鼠下颌骨骨缺损处;E组做空白对照;X线检查及硬组织切片分析新骨面积成骨量。结果:(1)培养3周脐血单个核细胞CD34、CD133、Flk-1、vWF抗体免疫荧光检测均为阳性;六周免疫荧光染色可见CD34、Flk-1、vWF为阳性,CD133部分为阳性。(2)脂肪干细胞培养新生牛血清组贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,免疫荧光检测可见CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;成骨诱导后碱性磷酸酶阳性;茜素红染色可见大量红色钙结节影;胎牛血清组大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在;多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CDl33部分为阳性,梭形细胞均为阴性;成骨诱导后多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶和钙结节阳性。(3)体外联合培养细胞1:1和3:1组14天细胞之间出现许多突触相互连接,部分细胞融合成团块状,其余组细胞未见细胞团出现。生长曲线可见各组混合细胞吸光度逐渐升高,脂肪干细胞、3:1、1:3、1;1浓度组12天时处于高峰,1:1浓度组吸光度最高;血管内皮细胞组第10天吸光度达到高峰;随后各浓度组细胞吸光度逐渐下降,差异有统计学意义。(4)体外培养第7天时ALP染色脂肪干细胞、3:1、血管内皮细胞组呈阴性反应,1:3和1:1组混合培养细胞部分细胞阳性;茜素红骨钙检测各组均未发现红色阳性细胞。14天时ALP染色脂肪干细胞、血管内皮细胞组仍呈阴性反应,3:1、1:3和1:1组混合培养细胞可见片状阳性细胞;茜素红骨钙检测3:1、1:3和1:1组混合培养细胞极少数阳性细胞,其余各组未发现阳性细胞;各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间1:1组ALP最高;脂肪干细胞组和血管内皮细胞组ALP基本没有变化;1:1组和其它各组之间两两比较均有显著统计学意义(P＜0.01);各组OC检测量随时间延长逐渐增高,4天时1:3组OC最高;7天和14天时1:1组OC最高;1:1组和其它各组之间两两比较均有显著统计学意义(P≤0.01)。(5)猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;细胞在部分脱蛋白骨上增殖曲线呈“S”形,在部分脱蛋白生物骨增殖曲线失去“S”形,第10天均达到高峰,各分组之间差异有统计学意义(P＜0.01);各细胞组在PDPBB上吸光度逐渐增加,第10天均达到高峰,1:1混合细胞组最高,各细胞组之间差异有统计学意义(P＜0.01);10天联合培养细胞细胞组大量细胞与PDPBB附着,呈巢状分布。(6)异位成骨第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,4周大量多核巨大破骨细胞位于支架材料周围长入材料内部,破坏、吸收支架材料;混合细胞组支架材料边缘开始出现均质、无细胞的类骨物质,孔隙内大量滋养血管形成;12周各组支架材料部分吸收,边缘模糊,易碎裂;各组边缘均可见均质的类骨物质出现,单纯PDPBB组较少,混合细胞组最多;部分切片上材料周边骨化中心;各组未见大量淋巴细胞侵润;新生骨形成联合细胞组最多,单纯PDPBB组较少,复合联合细胞组与各组之间差异有统计学意义(P＜0.01)。(7)外周血T淋巴亚群CD4/CD8变化曲线:单纯PDPBB组大鼠外周血CD4/CD8在1-8周期间逐渐升高,第8周时位于最高点,之后逐渐降低,与空白组比较有统计学意义(P＜0.05);复合VECs组第一周最高,1-3周逐渐降低,3-12周基本成直线状;复合ADSCs组、复合混合细胞组和空白组基本成直线状,与空白组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。(8)Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记BrdU空白组未见阳性细胞出现。(9)修复骨缺损第2周各组大量纤维组织包绕植入组织工程骨;空白组纤维组织已经封闭骨缺损;第4周各组植入材料不能移动,PDPBB复合血管内皮细胞组周围肌肉及纤维组织明显增厚,把组织工程骨和下颌骨连接成一体,组织工程骨血供较其他组丰富;第8周PDPBB复合联合培养细胞组组织工程骨空隙已经消失,与下颌骨骨性连接,表面部分材料已皮质化;第12周各组均已和下颌骨骨性连接,单纯PDPBB组、PDPBB复合脂肪干细胞和复合血管内皮细胞组材料部分吸收,材料大体形态还保留有原来形态;PDPBB复合联合培养细胞组形态大体和正常下颌骨相似,材料表面已皮质化;空白组骨缺损未被修复,骨断裂部分已经被骨皮质封闭,形成半圆形骨缺损区。(10)X线检查PDPBB复合血管内皮细胞组2周支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较宽,周围有新生骨痂生成;4-8周骨痂逐渐增多,12周时支架材料与下颌骨缺损之间的缝隙较前明显减淡,但支架材料大体形态依然存在。PDPBB复合脂肪干细胞组2周骨缺损周围骨痂开始生成,12周组织工程骨骨密度与正常骨质相比已基本相同;PDPBB复合联合培养细胞组4周-12周骨缺损周围骨痂生成随时间延长逐渐增加,8周已经骨性联合,骨缝已经消失;12周骨密度明显增加,骨形态已经基本恢复正常;单纯PDPBB组12周时支架材料骨密度较前减轻,与正常骨质对比明显;空白组8周和12周图像骨缺损面积减小,骨皮质已经封闭缺损端,仅剩下半圆或三角形缺损。(11)组织血检查新生骨形成混合细胞组最多,复合血管内皮细胞组次之,单纯PDPBB组较少,混合细胞组与各细胞组之间差异有显著差异(P＜0.01);复合血管内皮细胞组与复合ADSCs比较有统计学意义(P＜0.05);和单纯PDPBB组比较差异有显著差异(P＜0.01)。结论:(1)大鼠脐血来源的单个核细胞在体外诱导3周可以分化为EPCs,6周部分细胞分化为成熟血管内皮细胞。(2)新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞;脂肪干细胞培养胎牛血清培养含有大量的血管内皮细胞。(3)血管内皮细胞和脂肪干细胞体外培养下,细胞相互促进增殖;血管内皮细胞能在体外诱导脂肪干细胞向成骨细胞方向分化,1∶1比例细胞联合培养可以达到最好效果。(4)纤维粘连蛋白能促进细胞在PDPB支架材料上的增殖。(5)1∶1混合细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单种细胞,10天为最佳移植时机。(6)联合培养细胞组异位成骨能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力;各复合细胞组织工程骨机体内未引起明显免疫排斥反应。(7)组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成。(8)联合培养细胞组修复骨缺损能力最强,血管内皮细胞能增强组织工程骨成骨能力。