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第一部分 中国肌萎缩侧索硬化患者DNAJC7基因突变的研究[研究目的]:DNAJC7基因是2020年新发现的肌萎缩侧索硬化（ALS）的致病基因,本研究旨在探讨DNAJC7基因在中国ALS患者中的突变率及临床特点,优化中国ALS患者突变基因筛查的决策。[研究方法]:入组了 2017.8-2019.7就诊于北京协和医院神经科诊断为肯定ALS,拟诊ALS和实验室支持的ALS患者326例,其中散发ALS患者304例,家族ALS患者16例,ALS合并额颞叶痴呆6例,此外,2445名同种族健康对照者也纳入了本研究,用于分析健康人DNAJC7基因的突变率。采用全外显子检测技术（Whole Exome Sequencing,WES）进行基因分析,并使用PCR技术验证WES中发现的变异位点。我们使用gnomeAD及ExAC数据库分析健康人的变异频率,使用PolyPhen2,MutationTaster和SIFT软件预测错义突变的致病性,使用Phylop软件评估变异位点的保守性。我们依据美国遗传学和基因组学会2015年颁布的临床基因检测结果分析指南ACMG准则对每个突变位点进行致病性评级。[研究结果]:经过测序比对,发现DNAJC7基因的2处罕见杂合变异。一名球部起病患者DNAJC7基因的5号外显子上存在一处杂合错义变异c.410A>G,p.K137R,该突变位点在gnomeAD,ExAC数据库以及本地数据库中均不存在,且在哺乳动物中高度保守,MutationTaster,SIFT,Polyphen2软件预测结果分别为致病性,耐受性,及良性变异,p.K137R变异会改变DNAJC7蛋白TPR基序的a螺旋结构,依据ACMG指南标准为临床意义未明的变异（uncertain significant variant,VUS）。还有5名患者DNAJC7基因11号外显子上存在一处杂合错义突变,c.1106A>C,p.N369T。该位点在ExAC数据库中的变异频率为0.016%,ExAC数据库中的变异频率为0.029%,本地数据库中的突变频率为0.65%,MutationTaster,SIFT,Polyphen2软件预测结果分别为致病性,耐受性,及良性,依据ACMG指南标准,为VUS。这6例患者均未合并其他已知的致病突变。[研究结论]:DNAJC7基因不是我国ALS患者中的常见致病基因。我国ALS遗传背景及突变谱系与欧美人群存在较大差异。第二部分 肌萎缩侧索硬化患者基因型和睡眠障碍关系的研究[研究目的]:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种具有临床和遗传异质性的神经系统退行性疾病。除了锥体束受损的症状之外,还可以出现其他多系统受损的表现,例如认知功能障碍,行为异常,锥体外系症状等。本研究旨在探讨ALS患者是否存在睡眠障碍,睡眠障碍的特征,以及睡眠障碍与基因型之间的关系。[研究方法]:本研究是一项病例对照研究,纳入了从2018年4月至2020年1月就诊于北京协和医院神经科,依据Awaji标准被诊断为肯定的,拟诊的ALS患者204例,以及206例健康对照者。我们使用匹兹堡睡眠质量指数（Pittsburgh Sleep Quality Index,PSQI）评估ALS患者的睡眠质量,使用埃普沃思嗜睡量表（Epworth sleepiness scale,ESS）评估ALS患者的白日过度嗜睡（excessive daytime sleepiness,EDS）症状,使用快速动眼期睡睡眠行为障碍筛查量表（RBD Screening Questionnaire,RBDSQ）评估是否存在快速动眼期睡眠障碍（Rapid eye movement sleep behavior disorder,RBD）,依据国际不安腿综合征研究组（International Restless Legs Syndrome Study Group,IRLSSG）制定的诊断标准判断ALS患者是否合并不安腿综合征,采用修订版的ALS功能评定量表（Revised ALS Functional Rating Scale,ALSFRS-r）评估ALS患者的疾病严重程度。所有患者均行全外显子基因检测（Whole Exome Sequencing,WES）筛查ALS致病突变,依据基因检测结果将ALS患者分为伴基因突变的ALS患者（genetic ALS）以及不伴基因突变的ALS患者（non-genetic ALS）。[研究结果]:ALS组包括114例男性和90例女性患者,平均发病年龄为53.5±9.9岁,其中FALS 15例,SALS 189例。对照组中包括121例男性和85例女性,平均年龄为53.7±12.7岁。全部ALS患者均完善基因检测,共发现21例ALS致病突变,包括46.6%的家族性ALS（familial amyotrophic lateral sclerosis,FALS）和7.4%的散发性ALS（sporadic amyotrophic lateral sclerosis,SALS）。ALS患者和健康对照者相比:（1）PSQI得分更高[6.0（3.0,10.0）vs 3.5（2.0,5.0）（p<0.01）],多元logistic回归发现ALS患者发生睡眠质量差的概率是健康对照者的4.4倍（OR=4.4,95%CI 2.8 to 7.1;p<0.01）（2）ESS得分更高[6.0（3.0,10.0）vs 4.0（3.0,8.0）（p<0.01）]。多元logistic回归发现ALS患者发生EDS的概率是健康对照者的3.3倍（OR=3.3,95%CI 1.9to 5.9;p<0.01）。（3）ALS与健康对照者相比,更容易合并RLS（11.3%vs 1.0%,p<0.001）,多元logistic回归发现ALS患者发生RLS的概率是健康对照者的 12.7倍（OR=12.7,95%CI 2.9 to 55.8;p<0.01）。睡眠质量差的ALS患者较睡眠质量正常的ALS患者相比:（1）睡眠质量差的ALS患者的疾病严重程度更重[ALSFRS-r 40.0（37.0,42.0）vs 41.0（38.0,43.0）,p=0.017]。（2）睡眠质量差的ALS患者认知功能更差[MMSE 28.0（27.0,29.0）vs 29.0（28.0,30.0）,p<0.01;MoCA 23.0（20.0,26.0）vs 25.0（23.0,27.0）,p<0.01;FAB 15.0（13.0,16.0）vs 16.0（14.0,16.0）,p<0.01]。（3）睡眠质量差的ALS患者更易合并行为异常[FBI 3.0（1.0,7.0）vs 2.0（0.0,4.0）,p<0.01]和焦虑（40.7%vs 17.4%,p<0.01）、抑郁症状（48.3%vs 20.9%,p<0.01）。genetic ALS和non-genetic ALS 相比发现:（1）genetic ALS患者PSQI得分更高[10.0（6.0,14.0）vs 5.0（3.0,9.0）,p<0.01],genetic ALS更易出现夜间睡眠质量差（p=0.015）。（2）Genetic ALS的ESS得分更高[12.0（6.5,14.0）vs 6.0（3.0,9.0）,p<0.001],genetic ALS更易出现EDS（p<0.001）,logistic回归发现genetic ALS发生EDS的风险较non-genetic ALS 患者提高了 5.24 倍（p<0.01）。[研究结论]:ALS患者更易合并多种睡眠障碍,包括白日过度嗜睡,不安腿综合征,夜间睡眠质量差等;且携带突变的ALS患者较未携带突变的ALS患者,睡眠质量更差,更容易出现白日过度嗜睡,提示遗传因素可能是ALS患者睡眠障碍的原因。该研究拓宽了 ALS的基因型表型谱。第三部分肌萎缩侧索硬化患者血清及脑脊液细胞因子的研究[研究目的]:肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）存在促炎因子和抑炎因子的失衡。目前并未发现任何一种细胞因子可以单独地作为一种普遍的生物学标志物,具有良好的敏感性和特异性,能为ALS的诊断和预测预后提供帮助,多种细胞因子联合可能为ALS的诊断和预测预后提供线索。本研究旨在探讨ALS患者1)血清和脑脊液中的多种细胞因子的水平;2)多因子联合在ALS的诊断作用;3)多种炎症因子与病程,起病部位,ALSFRS-r得分,疾病进展速度,ECAS等多种临床特征之间的关系;4)纵向比较ALS血清细胞因子的变化。[研究方法]:本研究是一项前瞻性的,病例对照,随访研究。纳入了 141例慢性进行性的肢体无力,僵硬,或吞咽困难,声音嘶哑的患者。对其进行详细的问诊、神经系统查体,随后依据患者的病情,完善肌电图,腰椎穿刺,抗核抗体谱,颈椎MRI、腰椎MRI,基因检测等多项辅助检查,并随访观察患者病情的变化。141例患者均完善了静脉采血和腰椎穿刺,具有成对的血清和脑脊液标本,且腰穿和静脉采血的间隔时间<3天。最终,依据Awaji诊断标准,有81例患者被诊断运动神经元病。其余的60例患者经过查体、辅助检查、随访后,排除了 ALS的诊断,为ALS-mimic。这60例患者又依据是否有炎症反应参与疾病过程进一步分成了 2组:炎症介导组（n=31例）,和非炎症介导组（n=29例）。炎症介导组包括:慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病,多灶运动神经病,MUSK抗体阳性重症肌无力等;非炎症介导组包括:脊肌萎缩症,平山病,遗传性痉挛性截瘫,肾上腺脑白质营养不良等。此外,本研究还通过志愿者招募的方法纳入了 24例35-65岁的健康对照者。出于伦理的考虑,仅采集了这24例健康人的血清,并未进行腰椎穿刺留取脑脊液。所有ALS患者均登记进入北京协和医院ALS临床研究数据库注册系统。样本检测使用Bio-Plex 48因子试剂盒,其特点为将流式检测技术与芯片技术有机结合,为一项多因子检测技术。[研究结果]:1)四组血清细胞因子水平的比较ALS组中有26个血清细胞因子水平高于健康人,分别为:CTACK,basic FGF,G-CSF,GRO-α,HGF,IFN-α2,IL-1β,IL-1ra,IL-2Rα,IL-4,IL-6,IL-8,IL-13,IL-16,IL-17,MCP-1,MIF,MIP-1α,MIP-1β,RANTES,SCF,SCGF-β,SDF-1α,TNF-α,TRAIL,β-NGF。炎症介导的ALS-mimic组中有30个血清细胞因子的水平高于健康人,分别为:CTACK,basic FGF,G-CSF,GRO-α,HGF,IFN-α2,IFN-y,IL-1 β,IL-1ra,IL-2Rα,IL-4,IL-6,IL-8,IL-12（p70）,IL-13,IL-16,IL-17,IL-18,LIF,MCP-1,MIF,MIP-1α,MIP-1β,β-NGF,RANTES,SCF,SCGF-β,SDF-1α,TNF-α,TRAIL。非炎症介导的ALS-mimic组中有20个细胞因子的水平高于健康人,分别为:CTACK,basic FGF,G-CSF,HGF,IFN-α2,IL-1ra,IL-2Rα,IL-4,IL-8,IL-16,IL-17,MCP-1,MIF,MIP-1α,β-NGF,RANTES,SCGF-β,SDF-1α,TNF-α,TRAIL。炎症组血清中有7个细胞因子水平高于非炎组,分别为:Eotaxin,IL-1β,IL-7,IL-9,IL-13,IP-10,PDGF-BB。此外,ALS患者血清中IL-9的水平高于非炎症组（p=0.03）。而ALS组和炎症组相比,细胞因子水平没有明显差异。2)三组脑脊液细胞因子水平的比较ALS患者脑脊液中有9个细胞因子水平高于炎症组,分别为:CTACK,HGF,IL-2Rα,IL-9,IL-13,IL-16,MIP-1β,TNF-α,TNF-β。ALS患者脑脊液中有3个细胞因子水平高于非炎组,分别为:IL-4,IL-9,LIF。此外,炎症组患者脑脊液中TNF-β的水平高于非炎症组（p=0.028）。炎症组患者脑脊液中有3个细胞因子水平低于非炎组,分别为:CTACK,IFN-γ,MCP-1。3)脑脊液细胞因子的诊断效果鉴别ALS与炎症介导ALS-mimic:CTACK、HGF、TNF-β这3个因子联合诊断的灵敏度为93.8%,特异度为58.6%,阳性预测值为83.2%,阴性预测值为66.7%,阳性似然比为1.89,阴性似然比为0.17,AUC为0.72（0.59,0.86）。鉴别ALS与非炎症介导ALS-mimic:IL-4,IL-9,LIF这3个因子联合诊断的灵敏度为81.5%,特异度为65.5%,阳性预测值为86.8%,阴性预测值为55.9%,阳性似然比为1.69,阴性似然比为0.26,AUC为0.71（0.58,0.83）。综上,多因子联合诊断的诊断价值较差。4)基线细胞因子水平与临床特征之间的相关性脑脊液IL-6水平与病程呈正相关（p=0.009）,脑脊液MIG水平与病程也成正相关（p=0.038）。基线进展快组与基线进展慢组相比,进展快组的血清RANTES水平明显高于进展慢组;而进展慢组的脑脊液M-CSF,脑脊液SCGF-β水平明显高于进展快组。随访进展快组和随访进展慢组相比,随访进展快组的脑脊液Eotaxin明显高于随访进展慢组。此外,血清IL-7,血清TRAIL和脑脊液MIG与认知功能评分ECAS呈负相关。5)血清细胞因子水平的纵向比较与基线炎性因子水平相比较,随访血清SCF,SDF-1α,TNF-α水平明显下降。其余血清炎症因子并无明显改变。各细胞因子的变化（△Cytokine）与基线ALSFRS-r,随访ALSFRS-r,△ALSFRS-r,病程,DPR均无明显相关性。[研究结论]:本研究发现ALS患者存在多种细胞因子水平的改变,虽然这些细胞因子对ALS的诊断效果欠佳,但是多种因子与ALS的病程,疾病进展速度,认知功能有关。