球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种重要的昆虫病原真菌。近年来白僵菌归类于双核亚界(Dikarya)子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)粪壳菌纲(Sordariomycetes)肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)肉座菌目(Hypocreales)虫草菌科(Cordycipitaceae)虫草属(Cordyceps)。它不仅能引起野生昆虫的感染及疾病流行,而且一些菌株对家蚕也表现致病性。家蚕的体壁是阻碍病原真菌侵染的第一道天然屏障,对病原菌入侵的免疫防御具有重要作用。在球孢白僵菌粘附到家蚕体壁、穿透表皮过程中,蚕体发生的一系列生理、病理及免疫应答反应与球孢白僵菌侵染相关基因所作出的特异性应答有关,因此寻找和鉴定球孢白僵菌此过程涉及的相关基因,及对其功能的研究对进一步揭示球孢白僵菌致病机制具有重要意义。在本实验室前期球孢白僵菌不同致病性菌株比较转录组学研究中,获得了球孢白僵菌侵染家蚕体表过程中的大量差异表达基因。本研究从这些差异基因中选取侵染相关候选基因肽酶基因BbpepA00319,通过提取球孢白僵菌基因组DNA后进行了BbpepA00319基因的克隆,同时利用同源重组方法构建BbpepA00319基因敲除突变菌株;并检测分析了突变菌株的菌落形态特征、孢子产量、对化学物质敏感性及致病性,且均以野生型菌株作为对照进行比较分析。本实验通过对构建的BbpepA00319基因敲除突变株表型特征分析,初步阐明了该基因在球孢白僵菌生长发育及致病过程中的生物学功能。本文的主要研究结果如下:1.球孢白僵菌BbpepA00319基因的生物信息学分析基于本课题组前期的比较转录组学的研究结果,从中筛选出的侵染相关候选基因BbpepA00319作为靶标基因进行后续验证分析。通过对目的基因序列的生物信息学分析,显示该基因完整的开放阅读框ORF全长为1259 bp,共编码395个氨基酸。并进一步对该基因编码的蛋白质的氨基酸序列进行了生物信息学分析,结果表明所编码的蛋白分子量mw=41565.0u,理论等电点为5.77;其信号肽、结构域预测结果显示该蛋白n端前18个氨基酸为信号肽序列,无跨膜结构域;蛋白质二级结构预测结果表明该蛋白与丝氨酸蛋白酶的结构大致相似。对该蛋白的结构域peptidase_s8进一步分析,结果表明其为丝氨酸肽酶中的一个结构域。同源性分析发现,目的基因编码蛋白质对应的氨基酸序列与球孢白僵菌(beauveriabassianad1-5)的alkalineprotease1氨基酸序列具有较高的同源性,高达99%。由此我们推测基因bbpepa00319编码的蛋白可能属于丝氨酸蛋白酶。2.球孢白僵菌bbpepa00319基因敲除载体的构建及敲除突变株的筛选首选提取了球孢白僵菌gxsk1011基因组,并以此为模板dna通过设计特定的引物对目的基因5’和3’两端的侧翼序列,即用于基因敲除的左右同源交换臂pepa00319l和pepa00319r分别进行pcr扩增、回收目的片段并与克隆载体pmd19-t连接,获得含有目的片段的重组克隆载体。然后以pk2-bar质粒作为基因敲除的骨架载体,依次从含有目的基因左、右同源臂片段的重组克隆载体上酶切出相应的片段与pk2-bar骨架载体进行连接,成功构建了敲除载体pepa00319l-pk2-pepa00319r。最后,以球孢白僵菌gxsk1011为转化受体,利用agl-1根癌农杆菌介导的遗传转化法进行转化,并通过特异性引物的pcr扩增筛选敲除的肽酶基因bbpepa00319转化子。3.球孢白僵菌bbpepa00319基因敲除突变株表型分析对验证正确的敲除突变株进行了表型特征分析。首先以野生型菌株作为对照组观察与分析在sday培养基上的菌落形态、生长速率、产孢量,结果显示敲除突变株的菌落形态与野生型菌株无明显差异;Δbbpepa00319突变株的平均生长速率为3.96mm/d,与野生型菌株的平均生长速率3.79mm/d相比,两者无显著性差异;产孢量的检测结果表明,Δbbpepa00319突变株从第8d到16d的产孢量均高于野生型菌株,Δbbpepa00319突变株在第16天产孢量达到3.32×107conidia/cm2,显著高于野生型菌株的产孢量1.17×107conidia/cm2。暗示bbpepa00319基因涉及球孢白僵菌的产孢过程。其次,检测了敲除突变株对几种化学物质的敏感性。六种金属离子对野生型菌株的促进作用为51.3%-94%,对Δbbpepa00319突变株的促进作用仅为6.5%-20%,且cu2+(3mm)对Δbbpepa00319突变株有抑制作用,与对照组相比菌落生长率降低8.5%。说明Δbbpepa00319突变株相比野生型菌株对六种金属离子更为敏感;两种渗透剂对野生型菌株菌落生长没有明显作用,而对Δbbpepa00319突变株有抑制作用,生长率分别降低33.5%(1mnacl)和48.5%(1mkcl)。说明Δbbpepa00319突变株相比野生型菌株对两种渗透剂更为敏感;两种氧化剂、两种杀虫剂和三种细胞壁抑制剂对野生型菌株和Δbbpepa00319突变菌株的生长没有明显作用。以5龄起家蚕为测试昆虫,用体表接种的方式检测菌株毒力。接种的孢子浓度为106 conidia/mL时,ΔBbpepA00319突变株的LT50=9.28 d,野生型菌株LT50=7.1 d,两者具有显著差异(p<0.05);接种的孢子浓度为107 conidia/mL时,ΔBbpepA00319突变株的LT50=5.96 d,野生型菌株LT50=5.45 d,两者无显著性差异(p>0.05);接种的孢子浓度为108 conidia/m L时,ΔBbpepA00319突变株的LT50=5.53 d,野生型菌株LT50=5.38 d,两者无显著差异(p>0.05)。毒力实验结果表明BbpepA00319基因编码的肽酶可能参与了球孢白僵菌的早期侵染阶段,且在低浓度下ΔBbpepA00319突变株与野生型菌株相比,对家蚕的毒力明显地降低;在高浓度下二者没有显著差异。