角膜缘干细胞缺陷症是临床上常见的角膜盲的病因,眼表严重的化学伤及一些免疫性眼表疾病都可导致角膜缘干细胞缺乏,随之眼表血管化、角膜混浊,进而严重影响视力。目前针对角膜缘干细胞缺陷症比较有效的治疗方法是自体/异体角膜缘移植或体外培养的角膜缘干细胞移植。但对双眼角膜缘广泛损伤的患者,缺乏自体角膜缘干细胞来源,而目前临床应用的同种异体角膜移植或角膜缘移植存在着供体筛选、免疫排斥等一系列问题,大大影响治疗效果。成体干细胞横向分化功能的发现,推动了多源化组织工程角膜上皮的构建,有望成为一种新的治疗途径。选择合适的自体种子细胞是目前研究中首要解决的问题。角蛋白K3是角膜上皮特异性表达的蛋白,在口腔黏膜上皮细胞也有表达,且口腔黏膜取材相对隐蔽,愈后不留瘢痕等优点,有望成为组织工程中自体成体干细胞的一个新来源。本研究旨在对组织工程口腔黏膜的种子细胞的培养及生物学特性进行系统研究,探讨最适的种子细胞培养技术,并对组织工程口腔黏膜进行初步研究,为推进未来组织工程黏膜的研究和临床应用打下基础。第一部分兔口腔黏膜上皮细胞(含干细胞)的体外培养目的:探讨口腔黏膜上皮细胞体外培养方法方法:取兔口腔黏膜上皮组织,分别用中性蛋白酶DispaseⅡ和胰酶-EDTA分离获得上皮层,将其消化成单细胞悬液,一组以3T3成纤维细胞滋养层与传统口腔黏膜上皮细胞培养液(含FBS)构成上皮培养系统;另一组培养系统无血清、无滋养层,选用角质细胞专用培养液(Defined K-SFM)培养。比较二种培养体系下细胞活力、融合时间、细胞增殖特点、生长曲线及对细胞分化的情况。结果:口腔黏膜上皮细胞能够在无血清培养液中稳定增殖,可短期内获得大量黏膜上皮细胞,血清对上皮细胞有诱导分化作用。证明无血清培养液更利于口腔黏膜上皮细胞(含干细胞)体外保持良好的生长状态,并能在体外大量扩增培养。第二部分兔口腔黏膜上皮干细胞初步筛选和鉴定目的:组织工程技术首先要获取干细胞为种子细胞体外培养。获取足量干细胞并维持其生物学特性是我们研究的重点。方法:利用Ⅳ型胶原对干细胞快速黏附特性,将口腔黏膜上皮干细胞从上皮细胞单细胞悬液初步筛选出,进行体外培养及生物学特性观察,同时利用上皮干细胞相对特异标识物P63加以鉴定。结果:筛选细胞在体外呈克隆性生长;P63阳性表达,显示所筛选细胞为上皮干细胞。本部分获得处于良好生长状态的口腔黏膜干细胞,为后续实验奠定基础。第三部分兔口腔黏膜上皮干细胞培养构建组织工程黏膜目的:探寻兔口腔黏膜上皮干细胞培养构建组织工程黏膜的方法。方法:用本实验设计的组织工程黏膜培养系统,以口腔黏膜上皮干细胞为种子细胞,以去上皮羊膜为支架,体外构建组织工程上皮膜片,同时以兔角膜上皮为对照组。常规HE染色和透射电镜观察上皮膜片的形态和细胞结构,并同时检测上皮膜片细胞K3(上皮角化特异标识物)和P63(上皮干细胞相对特异性标识物)的表达。结果:口腔黏膜上皮干细胞可以在去上皮羊膜上形成无角化的类角膜上皮结构,并且底层存在上皮干细胞,超微结构符合上皮组织特点,表明口腔黏膜上皮干细胞可以在体外成功构建组织工程上皮膜片,同时仍保留一定的上皮干细胞,有利于损伤部位结构及功能的修复。综上所述,我们以去上皮羊膜为载体,用Defined K-SFM做培养液,采用气液界面培养方式,培养获得的兔口腔黏膜上皮干细胞-羊膜复合体具有与兔角膜上皮类似的表型,上皮细胞分化良好,基底层细胞能保留干细胞特性,上皮细胞间、上皮细胞与羊膜之间建立了较为紧密的连接,为临床治疗角膜缘干细胞缺乏提供了一种替代材料。但其在临床应用的可靠性和稳定性亟待进一步体内动物实验研究探讨。