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实验目的观察经黄芪多糖及内皮祖细胞治疗后糖尿病大鼠下肢动脉缺血区内微环境的改变,判断其是否通过增强血管内皮生长因子及其受体系统的表达,从而起到增强内皮祖细胞分化增殖能力、促进缺血区微血管重建,改善下肢功能的作用。实验方法:1.采用大鼠尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)联合高脂饲料喂养建立糖尿病大鼠模型。成年健康SD雄性大鼠建立糖尿病模型后,检测大鼠空腹血糖值,取2次空腹血糖≥16.7 mmol/L为成模糖尿病大鼠。2.将成模糖尿病大鼠随机分为5组:假手术组、下肢缺血模型组、下肢缺血+黄芪多糖治疗组、下肢缺血+内皮祖细胞治疗组、下肢缺血+联合治疗组;采用大鼠股动脉部分剥离术建立糖尿病大鼠下肢缺血模型。模型建立后,通过激光多普勒血流探测仪测定双下肢血流,观察术侧肢体缺血损伤程度。3.采用术侧肌肉多点注射黄芪多糖粉针剂、内皮祖细胞悬液治疗成模的糖尿病下肢缺血大鼠。下肢缺血+黄芪多糖治疗组肌注黄芪多糖粉针剂(2g/Kg)治疗,下肢缺血+内皮祖细胞治疗组肌注内皮细胞悬液(106/ml)治疗,联合治疗组同时肌注黄芪多糖粉针剂及内皮祖细胞悬液进行治疗。4.术后28天采用下肢血管造影技术观察各组缺血损伤区微血管重建情况。提取大鼠股四头肌肉,采用组织切片免疫组化染色技术检测术侧组织中微血管密度;采用Western Blot检测术侧组织中促血管生成相关蛋白(VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Tie-2)的表达量;采用RT-PCR检测上述促血管生成相关蛋白的mRNA水平。实验结果1.糖尿病大鼠下肢缺血模型建立后缺血肌肉组织中促血管生成相关蛋白(VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Tie-2)的表达量较假手术组升高(P<0.05),上述蛋白mRNA表达水平同时上升(P<0.05)。免疫组化染色提示VEGF、Flt-1、Flk-1在缺血肌肉组织中表达量升高,主要在血管内皮细胞中表达,血管平滑肌细胞中可见少量表达。2.黄芪多糖及内皮祖细胞多点肌肉注射治疗后,缺血肌肉组织中促血管生成相关蛋白的表达较下肢缺血模型组明显增加(P<0.05):VEGF(36.61%Vs 61.59%)、Flt-1(35.50%Vs 57.33%)、Flk-1(31.75%Vs 41.89%)、Ang-1(37.57%Vs 64.66%)、Tie-2(42.55%Vs 76.94%),相应蛋白mRNA表达量亦明显增加(P<0.05)。血管造影显示血管密度增加,下肢缺血区微血管循环开始重建。但黄芪多糖治疗组与内皮祖细胞治疗组缺血肌肉组织中促血管生成相关蛋白的表达水平无统计学差异。3.下肢缺血+联合治疗组其下肢肌肉组织中各蛋白表达量较缺血模型组显著增加(P<0.001):VEGF(99.67%)、Flt-1(105.33%)、Flk-1(72.05%)、Ang-1(114.30%)、Tie-2(111.87%),相应蛋白mRNA表达量亦显著增加(P<0.001)。血管造影显示血管密度增加明显,下肢缺血区微血管循环可见新生血管网。实验结论1.糖尿病大鼠下肢缺血模型建立后,下肢肌肉组织中促血管生成因子被激活,诱导新生血管网的重建,提示促血管生成因子(VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Tie-2)在糖尿病下肢缺血区微循环重建中起重要作用。2.黄芪多糖及内皮祖细胞可以增加缺血区促血管生长因子(VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Tie-2)的表达,促进缺血区微血管系统的重建,加快缺血区组织修复。3.黄芪多糖通过增强缺血区促血管生长因子(VEGF、Flt-1、Flk-1、Ang-1、Tie-2)的表达从而发挥微循环重建功能,黄芪多糖可以显著增强内皮祖细胞的血管新生作用,通过促血管生成因子表达量增多从而促进血管内皮的新生作用。