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白细胞介素lβ(IL-lβ)是IL-1家族中最重要的成员之一。大量的研究表明,作为一种重要的促炎症因子IL-lβ在炎症和疼痛的发生、自身免疫疾病、先天和获得性免疫反应中都发挥着重要的作用。特别是在炎症反应中IL-lβ的诱导表达及调控机制在控制炎症反应强度和维持免疫稳态方面发挥着决定性的作用。鱼类IL-lβ在基因定位、蛋白结构和分泌机制方面与哺乳动物同系物既有相似性也存在较大差异,但是目前对于鱼类IL-lβ诱导表达的调控机制仍然缺乏清楚的认识。在本论文中以草鱼为研究模型,在分析炎症条件和重组草鱼IL-lβ诱导IL-lβ表达的特征基础上,证明IL-lβ受体II(IL-1RII)和抑炎症因子(TGF-β1)参与了草鱼IL-lβ诱导表达的负调控过程,并阐明了相关分子机制。研究内容如下:1.炎症条件下草鱼IL-1β的诱导表达:(1)通过同源克隆技术获得草鱼IL-1β的cDNA全序列,再采用生物信息学方法分析所得基因。(2)通过荧光定量PCR(qPCR)技术发现草鱼IL-1β在草鱼头肾、肝、肾、胸腺、脾等免疫器官中表达量较高,证明草鱼IL-1β发挥免疫功能的场所十分保守。(3)在细菌脂多糖(LPS)刺激草鱼头肾白细胞(HKL)的体外模型中,发现LPS可以迅速地诱导IL-1β的高表达但诱导表达强度随着时间降低。(4)在嗜水气单胞菌活体感染草鱼的体内模型中,发现感染后IL-1β的诱导表达迅速上升,但随后又下降。体外体内的实验都表明在炎症反应条件下草鱼IL-1β的诱导表达呈现快速和瞬时的特征。2.草鱼IL-1β的自我诱导表达:(1)通过重组表达和纯化获得了高纯度重组草鱼IL-1β蛋白,通过qPCR和检测细胞活力的CCK8实验证明该重组蛋白具有生物学活性。(2)以重组草鱼IL-1β蛋白为抗原委托制备多克隆抗体,通过免疫印迹(WB)实验证明所获多克隆抗体能够特异识别草鱼IL-1β蛋白。(3)在重组草鱼IL-1β蛋白刺激HKL后,发现重组IL-1β在1小时内即可诱导自身表达,随后诱导表达倍数迅速降低,其细胞信号传导机制包括MAPK和NFκB信号通路。3.草鱼IL-1受体II(IL-1RII)的分离鉴定及其对IL-1β诱导表达的负调控作用:(1)通过同源克隆技术分离了草鱼IL-1RII的cDNA全序列,生物信息学方法揭示了所得基因与其它物种同源基因之间的进化关系。(2)采用qPCR检测发现草鱼IL-1RII在肝、脾、头肾和鳃组织中表达量较高。(3)在炎症反应条件下,草鱼IL-1RII在体内和体外模型中均可被诱导表达,而对照组的IL-1RII基因表达水平均无变化,表明IL-1RII的诱导表达对于炎症刺激的依赖性。(4)在重组草鱼IL-1β蛋白刺激HKL的细胞模型中,重组草鱼IL-1β可以通过MAPK和NFκB信号通路诱导草鱼il-1rii的表达。(5)通过重组表达、亲和和分子筛层析分离纯化获得了高纯度重组草鱼il-1rii的胞外区蛋白。基于elisa的蛋白结合实验证明重组草鱼il-1rii胞外区蛋白可以在体外与重组草鱼il-1β相结合。(6)重组草鱼il-1rii可以在体外显著抑制重组草鱼il-1β对自身基因的诱导表达。这些实验结果证明在炎症反应或草鱼il-1β刺激下产生的草鱼il-1rii可能是负调控草鱼il-1β表达的机制之一。4.草鱼抑炎症因子对il-1β诱导表达的负调控作用:(1)不论在嗜水气单胞菌感染的体内模型还是lps刺激hkl的体外模型中,草鱼抑炎症因子tgf-β1均被诱导高表达,而对照组的tgf-β1基因表达水平均无变化,表明tgf-β1可能参与了炎症反应的调节。(2)在草鱼hkl中发现重组草鱼il-1β蛋白可以通过mapk和nfκb信号通路诱导tgf-β1基因的表达,提示tgf-β1可能以反馈方式参与il-1β的调节作用。(3)草鱼tgf-β1的抗体中和实验发现草鱼tgf-β1抗体可以延长il-1β对自身诱导表达的作用时间,证明内源性的tgf-β1参与了草鱼il-1β的自我诱导作用。(4)上述结论被以下实验结果证实:草鱼hkl中重组草鱼tgf-β1可以抑制重组草鱼il-1β的自我诱导表达作用。(5)在机制方面,wb分析证明重组草鱼tgf-β1可以通过抑制iκb的磷酸化来影响nfκb信号通路的激活,从而降低重组草鱼il-1β对自身基因的诱导表达作用。(6)同时,重组草鱼tgf-β1可以在体外抑制重组草鱼il-1β对其受体相关基因(il-1ri和il-1racp)的诱导表达作用。相反,重组草鱼tgf-β1刺激对il-1β信号具有抑制作用的il-1rii的表达,并放大重组草鱼il-1β对il-1rii的诱导表达作用。因此,重组草鱼tgf-β1在抑制il-1β信号放大相关基因(il-1ri和il-1racp)表达的同时又能增强il-1β信号内源天然拮抗剂(il-1rii)的表达,从而双重有利于tgf-β1抑制il-1β信号的作用。(7)另一方面,qpcr和wb实验发现重组草鱼il-1β可以上调tgf-β1的i型受体(alk5)的表达,并能放大重组草鱼tgf-β1对alk5的诱导表达作用。此外,重组草鱼il-1β可以增强重组草鱼tgf-β1引起的smad2磷酸化水平,证明il-1β可以放大tgf-β1的信号传导。(8)在嗜水气单胞菌感染的体内模型中发现重组tgf-β1可以抑制细菌感染对草鱼il-1β的诱导表达作用,证明了重组tgf-β1在体内的抑炎症功能。这些实验结果证明草鱼tgf-β1通过影响il-1β受体相关基因(il-1ri、il-1racp和il-1rii)的表达和细胞信号通路(nfκb)的激活来抑制草鱼il-1β对自身基因的诱导表达;反之,il-1β可以放大tgf-β1的信号传导。因此,il-1β和tgf-β1的相互作用构成了草鱼il-1β诱导表达的负调控机制之一。总之,本论文在明确草鱼il-1β的两种诱导表达(炎症诱导和自我诱导)方式的基础上,分别揭示了基于内源天然拮抗剂(il-rii)和抑炎症因子(tgf-β1)负调节IL-1β诱导表达的方式和原理,从而诠释了在鱼类基于IL-1β信号引起的炎症反应放大过程中的控制机制。本论文的发现不仅揭示了鱼类维持免疫稳态的两种重要分子机制,而且有利于了解先天性免疫系统自调控的进化信息。另外,也为草鱼养殖病害的免疫防治提供了潜在的靶点。