腐植酸（humic acid, HA）是生物有机质在微生物的分解转化下，经由长期的反应和积累，而得到的一类结构功能十分复杂的混合物。生物腐植酸菌剂（biotransfulationfulvic acid, BFA）是由秸秆或木屑等，辅以豆粕、麦麸等发酵原料，在合适的温度、湿度下，由一种或多种有益菌群发酵、转化得到的混合物。BFA是多种物质的复合体，本质上为一种合生元类微生态制剂[1-3]。本研究所采用的生物腐殖酸菌剂（BFA），是运用发酵工程和酶工程核心技术，结合优良的益生菌菌株，以白酒丢糟为主要生产原料，以益生菌-复合酶耦合生物转化为主、物理和化学处理为辅的创新工艺路线，制备所得。其中含有发酵产物黄腐酸（fulvicacid，FA）以及参与发酵的益生菌，使其有机结合了腐植酸和益生菌的功能。BFA通过益生菌发挥与有害菌的竞争性排斥作用，从而调节肠道菌群平衡，辅助动物建立有利于宿主胃肠道微生物区系，提高机体免疫力，预防腹泻，改善胃肠对营养物质的消化和吸收，提升动物生长性能，提高饲料利用率[4-7]。同时，BFA中含有的多种氨基酸、核酸、肌醇、多维、多糖等物质可参与机体新陈代谢的多个反应过程，这些有益物又是动物生长不可或缺的营养物质，有效地促进了动物的健康生长[8]。BFA能使饲料中各种大分子养分有效充分的转化成小分子营养物质，更有益于胃肠对其消化和吸收。BFA中有效成分生物腐植酸含有醌基，可进入机体的多个氧化还原反应过程，促进新陈代谢[9-11]。目前，生物腐植酸菌剂已广泛应用于农业的各个领域，如用作饲料添加剂、土壤改良剂、植物生长调节剂、有机肥发酵剂等产品中，在高效生态农业应用方面展现出广阔的市场前景[12-13]。本文第一章对生物腐植酸菌剂（BFA）进行了来源标准化研究，即产品质量稳定性检定系统的建立；第二章则将符合拟定标准、且已经过标准化分析的BFA按比例添加至常规饲料中，以哺乳动物（SD大鼠）为研究对象，观察BFA对SD大鼠的一般生活状况、生长性能、血液指标、肠道菌群及免疫指标等的影响，初步探讨BFA用作饲料营养添加剂的安全性能及功效学价值。方法：1.生物腐植酸菌剂（BFA）来源标准化及营养价值研究对未发酵的白酒丢糟原料及其四种生物腐植酸菌剂-BFA（即乳酸菌发酵BFA、芽胞菌发酵BFA、酵母菌发酵BFA、三菌混合发酵BFA）进行产品来源标准化研究，即产品质量稳定性检定系统的建立；系统的测定指标包括：感官分析、总腐植酸（HA）、黄腐酸（FA）、益生菌活菌数、粗蛋白（CP）、粗纤维(CF)、粗脂肪(EE)、粗灰分(ASH)、无氮浸出液(NFE)、P、Ca、干物质以及氨基酸含量等指标。其中，腐植酸和黄腐酸含量测定采用容量法，益生菌活菌数采用平板计数法，饲料营养成分检测依据国家标准（方法）编号、名称：粗蛋白GB5009.5-2010；粗纤维GB/T5009.10-2003；粗脂肪GB/T5009.6-2003；灰分GB5009.4-2010；磷GB/T5009.87-2003；钙GB/T5009.92-2003；水分GB5009.3-2010；无氮浸出物=100-（粗蛋白+粗脂肪+粗纤维+灰分+水分）。氨基酸含量测定采用日立L-8800氨基酸自动分析仪检测。采集汇总各组上述指标的检测结果。2.生物腐植酸菌剂（BFA）用作饲料添加剂的功效研究实验组：将四种标准化检定合格的中试级生物腐植酸菌剂（分别为乳酸菌-BFA、芽胞菌-BFA、酵母菌-BFA、三菌混合发酵-BFA），按1.5%的比例添加至常规饲料中。对照组：以未添加任何生物腐植酸菌剂的常规饲料为对照。饲喂SD大鼠4周，观察并记录各组生物腐植酸菌剂以及常规饲料对实验组和对照组大鼠的一般生活状况、生长性能、生理生化和免疫指标、肠道菌群的影响。结果：1．生物腐植酸菌剂（BFA）来源标准化及营养价值研究结果本研究拟定BFA的基础指标：黄腐酸（FA）含量≥16%；益生菌含量≥2×108cfu/g。（1）总腐植酸（HA）和黄腐酸（FA）含量分析：未经发酵的白酒丢糟，经检测腐植酸含量为41.63±0.21%，黄腐酸含量为14.36±0.19%，FA低于拟定BFA合格标准，在后续营养成分分析和功效学研究中不予采用。四种发酵后所获BFA均符合HA、FA的拟定标准，并发现其中混合发酵-BFA组总HA和FA含量显著高于各单菌发酵（乳酸菌、酵母菌、芽孢菌）-BFA组（P<0.01）。（2）益生菌活菌计数：四种发酵BFA（乳酸菌发酵-BFA、酵母菌发酵-BFA、芽孢菌发酵-BFA、混合发酵-BFA）中的活菌计数均符合拟定标准；（3）感官分析：四种发酵BFA的色泽、混合均匀度，无霉变、结块等，符合国家饲料添加剂相关标准。（4）饲料营养成分分析：检测四种发酵BFA中的粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、钙、磷、干物质和无氮浸出物，其中混合发酵-BFA的粗蛋白和粗脂肪显著高于其他各单菌发酵组（乳酸菌发酵-BFA、酵母菌发酵-BFA、芽孢菌发酵-BFA）（P<0.01）；混合发酵-BFA组磷的含量显著高于乳酸菌发酵-BFA组、芽孢菌发酵-BFA组（P<0.01）而与酵母菌发酵-BFA组比较无显著性差异。（5）氨基酸分析：四种发酵BFA均含有17种以上的氨基酸，种类丰富，满足动物生长发育中所需的多种必需氨基酸。2．生物腐植酸菌剂(BFA)用作饲料添加剂的功效研究结果（1）动物一般状况观察：实验组(四种BFA发酵组)和对照组（常规饲料组）SD大鼠一般生活状况良好，进食、饮水正常，精神状态、活动良好，未发现病、死等现象。（2）血常规指标：乳酸菌发酵-BFA组、混合发酵-BFA组的白细胞、淋巴细胞、单核细胞较对照组升高，差异有显著性（P<0.05）；酵母菌发酵-BFA组白细胞较对照升高，差异有显著性（P<0.05）。（3）血生化指标：乳酸菌发酵-BFA组白蛋白、总蛋白、白/球比值与对照组比较显著升高（P<0.05），总胆红素与对照组比显著降低（P<0.05）；芽孢菌发酵-BFA组的总胆红素与对照组比显著降低（P<0.01）。（4）增重、料重比：混合发酵-BFA组日增重和总增重均显著高于对照组（P<0.05）；混合发酵-BFA组饲料利用率最高，与对照组相比提高10.04%；酵母菌发酵-BFA组次之，饲料利用率与对照组相比提高4.14%。（5）肠道菌群分析：混合发酵-BFA组和乳酸菌发酵-BFA组大肠杆菌数量较对照组显著降低（P<0.05），同时乳酸杆菌数量较对照组显著升高（P<0.05）。（6）免疫指标分析：胸腺指数和脾脏指数：混合发酵-BFA组和乳酸菌发酵-BFA胸腺指数显著高于对照组（P<0.05）；混合发酵-BFA组脾脏指数高于对照组，差异有显著性（P<0.01）。血清免疫学指标：混合发酵组IgA、IgG、IgM、IL-2较对照组升高，差异有显著性（P<0.05）；乳酸菌发酵-BFA组IgA、IgG、IL-2较对照组升高，差异有显著性（P<0.05）。结论：1.生物腐植酸BFA的标准化检定：乳酸菌-BFA、酵母菌-BFA、芽孢菌-BFA、混合发酵-BFA的黄腐酸（FA）、益生菌含量均符合拟定标准；而未发酵的BFA原料（白酒丢糟）黄腐酸含量低于BFA拟定标准，未检出所需益生菌，故后续含量分析和功效学研究未予采用。2.生物腐植酸BFA用作饲料添加剂的营养学评估：感官分析符合国家标准；营养成分分析以混合发酵-BFA组的粗蛋白和粗脂肪最高；氨基酸分析显示各组BFA产品均含种类丰富的氨基酸，涵盖了动物生长发育中所需的多种必需氨基酸。3.生物腐植酸BFA的饲喂效果：BFA饲喂后，SD大鼠一般生活状况良好，提示其具有较高安全性；各组BFA均可促进大鼠生长，其中以混合发酵-BFA组的总增重、日增重、饲料利用率等指标的增高最显著，且呈现两个快速增长期的特点。4.生物腐植酸BFA显示的生理作用：可改善SD大鼠肠道菌群，抑制有害菌繁殖，促进益生菌生长；可改善机体的体液和细胞免疫功能，提高机体整体抗病能力，其中混合发酵-BFA及乳酸菌发酵-BFA对胸腺指数、脾脏指数和免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）的提升显著优于对照组；结果尚提示生物腐植酸BFA可增强大鼠肝脏蛋白质合成能力。5.生物腐植酸BFA未对大鼠的肝脏和肾脏功能产生不良影响。