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外泌体(exosomes,Exos)是细胞分泌囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一个亚群,广泛存在于体液和细胞中,具有很多亲本细胞的特性,用于细胞间的通信和信号调节。最近,Exos在天然治疗平台和药物递送系统中受到越来越多的关注,并且很多研究已经证明Exos作为药物递送系统的可行性。目的:该研究关注经典活化的巨噬细胞分泌(M1-mcarophages,M1)的M1-Exos,探讨其激活巨噬细胞(macrophages)的NF-κB信号通路,促进巨噬细胞释放炎性细胞因子,是否可以增强化疗药物的抗肿瘤活性。方法:(1)超高速离心法提取巨噬细胞来源的Exos;透射电镜观察(TEM)Exos形态;动态光散射(DLS)和纳米粒子示踪技术(NTA)检测Exos电位和粒径分布;Western Blot法检测Exos蛋白标志物;采用激光共聚显微镜观察小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)对Exos摄取;流式细胞仪检测摄取率。(2)建立巨噬细胞/4T1共培养体系,验证M1-Exos和M2-Exos的抗肿瘤作用;采用RT-PCR法检测NF-κB、i-κB、iNOS、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-4及IL-10的相对表达量;采用Elisa法检测IL-4、IL-12及TNF-α的含量;采用Caspase-3试剂盒检测肿瘤细胞中Caspase-3的活性。(3)超声法构建M1-Exos载紫杉醇(PTX-M1-Exos)药物递送体系;HPLC法测定紫杉醇的包载量,并对其形态、粒径、Zeta电位进行表征。(4)体外选用小鼠4T1细胞为研究对象,通过MTT实验、流式细胞术进行了体外抗肿瘤研究;体内药效实验选用4T1荷瘤小鼠模型为研究对象,通过Western Blot,TUNEL,H&E等实验进行药效评估。结果:(1)经典的超高速离心法从不同巨噬细胞的培养基中,提取分离出不同类型的Exos。透射电镜结果显示提取物的直径范围30-150 nm之间,具有明显的茶托样双膜结构,有的单个分布,有的聚集成群,背景较为清晰,污染物少。DLS和NTA实验结果表明提取物的粒径在200 nm以下。Western Blot检测结果显示,Exos特异性蛋白TSG101,CD63及Alix在Exos中均有表达。通过以上实验结果表明超高速离心法得到的沉淀物即为Exos。此外摄取实验显示,提取出的Exos可以被小鼠肿瘤细胞4T1摄取。(2)巨噬细胞/4T1共培养体系中,M1-Exos可以激活巨噬细胞的NF-κB通路,使得巨噬细胞向M1型极化,释放大量的炎性细胞因子(IL-6,IL-12和TNF-α)。同时对Caspase-3的检测结果发现,M1-Exos给药组肿瘤细胞的Caspase-3活性明显增加,提示M1-Exos可以诱导肿瘤细胞的凋亡。(3)制备的PTX-M1-Exos载药体系从外观形态上看,PTX-M1-Exos载药体系和单独的M1-Exos一样,呈类球状有明显的茶托样双层膜结构,平均粒径130.9 nm和M1-Exos(78.4 nm)相比略微增加,平均电位分别为-17.5 mV和-13.7mV,超声处理后sonicated-M1-Exos的形态,粒径和电位均没有明显的改变。(4)PTX-M1-Exos的体内外药效学研究结果表明,空白的M1-Exos(浓度40μg/mL)体外单独对肿瘤细胞基本无毒副作用,而PTX-M1-Exos可以更好的抑制肿瘤细胞的生长。而体内实验中,单独的M1-Exos组也表现出抑制肿瘤生长的趋势,M1-Exos作为载体本身并不能杀伤肿瘤细胞,但是可以通过激活体内的免疫细胞而发挥间接的抗肿瘤作用。结论:在这项研究中,我们成功构建了Exos载紫杉醇的药物递送系统,将紫杉醇递送至4T1肿瘤细胞中。其中,体内外药效实验实验表明,Exos递送系统不仅增加了PTX的水溶性和抗肿瘤作用,而且还降低了紫杉醇的毒副作用。总之,该课题的思路为Exos作为载体应用于临床提供了一定的理论基础。