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结直肠癌(Colorectalcancer,CRC)是全球第四大致死性癌症,仅次于肺癌、肝癌和胃癌,每年有近90万人死于CRC。在中国,随着人民的生活水平不断提高,以及越来越多的人转向西方饮食和生活方式,CRC的发病率逐年增加。病理生理学等基础学科的发展提高了人们对疾病的了解,使CRC的治疗从内窥镜、手术局部切除术和转移性疾病的广泛手术转向转移灶的局部消融治疗、姑息化疗、靶向治疗和免疫治疗等个性化治疗。尽管这些新的治疗方法使CRC的总生存期有所提高,但转移、复发以及耐药CRC患者的死亡率尚未得到显著改善。奥沙利铂于2000年被引入治疗转移性CRC的研究中,在此之前顺铂和卡铂已被证明是无效的,结果显示奥沙利铂不仅显著提高客观缓解率,改善转移切除的百分比,而且还提高了患者的总体生存率(Overall survival,OS)。因此,奥沙利铂被广泛用作转移性CRC的标准一线化疗药物。不幸的是,基于奥沙利铂的单独疗法或联合疗法的获得性耐药是治疗失败的主要原因,化学抗性的发展限制了其在临床治疗中的有效性。因此,阐明这一现象的根源,并找到更好的抗癌方法至关重要。目前众多研究重在从基因组水平结构揭示奥沙利铂耐药的分子机制,但耐药发生前后癌细胞基因组的三维空间结构有何变化,且三维空间结构是如何调控耐药性的获得仍然未知。在本课题中,我们探讨了 CRC细胞株在耐药性获得前后的基因组三维空间结构的差异,并筛选到一些耐药相关基因通过染色质构象调控CRC耐药性的获得。主要研究内容可分为以下三部分:(一)构建抗奥沙利铂的结直肠癌细胞系HCT116OxR:应用浓度梯度法使CRC细胞系HCT116转变为耐奥沙利铂的细胞系HCT1160xR;利用CCK-8法检测奥沙利铂对两种细胞系的IC50值;使用细胞迁移、侵袭、划痕方法和检测上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物证实 HCT1160xR比HCT116的恶性程度更高,进一步证明HCT1160xR细胞系构建成功。(二)基于DLO Hi-C技术研究结直肠癌细胞系在抗奥沙利铂前后基因组三维空间结构的变化:应用同时酶切酶连的高通量染色质构象捕获技术(Digestion-ligation-only high-throughput chromosome conformation capture,DLO Hi-C)分析CRC细胞系HCT116抗奥沙利铂后引起的基因组三维空间结构改变。结果显示:代表转录活性的染色质区室(Compartment)保守,约20%的Compartments 出现转换;拓扑相关结构域(Topological associated domain,TAD)高度保守,TAD的大小和数量均无显著差异;染色质环(Loop)的数量和互作强度显著下降。(三)与RNA-seq和ChIP-seq联合分析筛选通过染色质构象调控耐药性获得的关键基因:应用RNA-seq技术检测两组细胞系的差异基因并富集KEGG信号通路;应用染色质免疫沉淀测序技术(Chromatin Immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)检测代表转录活性的 H3K4mel,H4K4me3,H3K27me3和H3K27ac的强度;对Compartment A-B/B-A的基因和RNA-seq下调/上调的基因分别富集分析发现GSTA1,HBB,CYP2C9,LEF1和PRDX6等关键基因,并假设:肿瘤细胞中奥沙利铂耐药性的获得是由于活性染色质构象改变介导的活性氧(ROS)减少和转移能力增强所致;在HCT1160xR细胞中使用RNAi 技术降低淋巴样增强因子 1(Lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF1)的表达,通过CCK-8检测降低LEF1的表达可以减弱耐药细胞的耐药性,并通过细胞迁移,侵袭方法和检测EMT相关分子的表达证明降低LEF1的表达可以降低耐药细胞的侵袭转移能力。综上所述,本课题明确了 CRC细胞系在获得了抗药性以后对基因组三维空间结构产生影响,如20%基因组实现A/B Compartments转换,TAD结构域高度保守和loop的数量显著减少;筛选到GSTA1,HBB,CYP2C9,LEF1和PRDX6等关键基因通过基因组三维构象变化调控耐药性的获得;证实在耐药细胞中降低LEF1的表达可以逆转肿瘤耐药。