蛋白质是生物功能的主要执行者,也是很多药物的作用靶标,或者蛋白质本身就是药物,因此,蛋白质组学的研究成为目前生命科学研究的亮点和热点。在各种蛋白质组学分析方法中,质谱(MS)因其高灵敏度和能提供结构信息等优点已成为必不可少的重要技术手段。基于MS的蛋白质组学研究策略主要涉及到以下几个方面:蛋白质样品前处理、蛋白质的分离与检测、蛋白质酶解以及多肽的分离与检测。近些年来,已有很多成熟的分析技术和方法得到了应用,但仍存在一些挑战和需要解决的问题。例如,传统溶液酶解时间长、酶自身降解严重;样品前处理中用到的一些试剂,如表面活性剂、非挥发性盐等,会影响蛋白质的分离和MS检测,需要除去;液相色谱(LC)流动相添加剂三氟乙酸(TFA)抑制样品离子化,降低MS检测灵敏度,等等。　　针对这些问题与不足,本课题组周宇等人利用膜、电场和微流控技术发展了一种新型的微型电纯化装置(MEPD),可一步实现蛋白质样品的高效除盐和蛋白质的富集。本论文基于上述研究结果,利用膜和电场技术构建了新型的基于膜和金纳米粒子修饰膜的酶微反应器并用于蛋白质的高效酶解;利用双极膜电渗析发展了一种“连续型”的TFA在线去除装置,旨在解决TFA与MS不兼容的问题;还利用MEPD实现了基于蛋白质等电点的目标蛋白质选择性提取与检测。具体研究结果如下:　　(1)基于阳离子交换膜的酶微反应器的构建及其在蛋白质分析中的应用　　构建了新型的基于阳离子交换膜的酶微反应器。该酶微反应器通过静电作用和疏水作用将胰蛋白酶固定在阳离子交换膜上,对酶活性影响较小,而且固定化过程只需要2 min,与已报道的酶固定化技术相比,时间大大缩短。此外,酶微反应器在完成一次蛋白质酶解后快速再生,完全避免了不同次实验间酶解结果的相互干扰,提高了蛋白质鉴定的准确性。我们将此酶微反应器与液相色谱-质谱(LC-MS)在线联用,成功用于蛋白质的鉴别。测试的三种标准蛋白质(细胞色素C、肌球蛋白和牛血清蛋白)的序列覆盖率均与溶液酶解水平相当,甚至优于溶液酶解,但酶解时间大大缩短;用于酵母细胞裂解液的分析共检出130种蛋白质。构建的酶微反应器-LC-MS联用系统,可在线完成蛋白质酶解、多肽样品的除盐、分离与检测,为蛋白质组学分析提供了高效、自动化的技术平台。　　(2)金纳米粒子自组装修饰阴离子交换膜在酶的固定化中的应用　　金纳米粒子具有独特的表面和电荷性质,可以通过静电作用自组装到阴离子交换膜表面上,修饰过程简单;膜上结合的金纳米粒子分布均匀,结合牢固。以金纳米粒子修饰的阴离子交换膜为载体构建了酶微反应器,并用于标准蛋白质和兔血中提取血红蛋白的酶解,在十几秒的酶解时间内均可得到理想的序列覆盖率。结果证明,酶解速度快,反应重复性好。此外,酵母细胞经过简单处理后用该酶微反应器酶解共检出98种蛋白质,证明了该酶微反应器用于复杂样品分析的可行性。　　(3)在线三氟乙酸去除装置的构建与应用　　利用双极膜电渗析原理构建了新型的“连续型”TFA去除装置。该装置利用电渗析原理可以高效除去流动相中的TFA,同时利用双极膜电解产生的氢氧根离子对阴离子交换膜进行快速再生,故无需额外的再生步骤,且可连续使用。将该装置用作含TFA流动相的常规LC与MS在线联用的接口,解决了含TFA的LC流动相与MS不兼容的问题。研究表明,以该装置为接口搭建的LC-TFA去除装置-MS在线联用系统用于碱性小分子和蛋白质的分析,均可消除TFA对检测灵敏度的影响,定量分析线性关系好,结果重复性好。　　(4)基于等电点的目标蛋白质的选择性提取与检测　　通过调节蛋白质溶液pH至目标蛋白质等电点,使目标蛋白质不带电而其他蛋白质带有电荷后,利用MEPD可以吸附带电化合物而使不带电化合物直接通过装置的特点,从蛋白质混合物中选择性提取目标蛋白质,同时实现样品的除盐,简化了蛋白质样品前处理步骤;MEPD可以直接与MS联用,用于目标蛋白质快速检测。