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研究目的：抗菌肽是生物体内合成的一种具有抗菌活性的多肽类物质，对多种病原体乃至耐药性菌株具有明显的杀伤作用，是固有免疫及适应性免疫的重要参与物质。广泛存在于动物、植物、昆虫体内，目前为止发现抗菌肽已有1700多种。抗菌肽通过膜结构破坏、胞内容物损伤、选择性杀伤等机制达到抵御病原微生物目的，具有抗生素无法比拟的优势，因此深入研究抗菌肽具有重要性和必要性。HβD-3是人体内一类内源性多肽，与其它β-防御素相比，耐高盐，具有灭活多种耐药性菌株的能力。目前HβD-3的来源主要是化学合成和基因工程表达。化学合成成本高及时间长，限制了研制与应用；而在微生物内表达量往往偏低，难以达到生产化的要求。因此，针对如何高效表达和快速纯化这个问题，本研究选用的Dr.David研发的pET-EI质粒载体在E. coli BLR (DE3)表达HβD-3，具有经济适用价值，为实现HβD-3产业化奠定基础。研究方法：1借助DNAclub软件，根据大肠杆菌密码子偏好性改造出两条新的序列HβD-3i和HβD-3ii2通过SOE法人工合成三条目的基因：原始序列HβD-3、密码子改造序列HβD-3i/HβD-3ii3通过酶切、连接反应，构建表达载体pET-EI-HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii，转入大肠杆菌JM109，提取质粒测序鉴定4制备感受态细胞E.coli BLR(DE3),把测序鉴定正确的质粒转化至表达菌E.coliBLR(DE3),提取质粒，PCR鉴定阳性克隆菌落5将正确表达载体转化子E.coli BLR(DE3)进行小量试表达6实现表达条件优化，探讨最佳表达温度和时间7在最佳表达温度和时间下进行中量表达8表达后的蛋白质进行ITC法纯化，优化纯化条件，Tricine-SDS-PAGE鉴定表达，目的蛋白浓缩，BCA法测定目的蛋白表达量9利用琼脂糖扩散实验初步判断重组抗菌肽对伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的活性；通过测定最低抑菌浓度（MIC）定量检测重组抗菌肽对伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的活性；通过重组抗菌肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，进行重组抗菌肽动力学研究。研究结果：1本研究成功构建pET-EI-HβD-3E. coli BLR (DE3)质粒载体，同时利用大肠杆菌密码子偏好性成功构建pET-EI-HβD-3i/HβD-3ii E. coli BLR (DE3)质粒载体。2质粒载体pET-EI-HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii进行小量试表达，优化了表达及纯化条件，最佳的表达温度为12~14℃，最佳表达时间为48h；纯化裂解最佳温度为37℃，最佳裂解时间为24h。3在最佳温度及时间条件下表达，HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii的表达量分别为0.123mg/mL、1.479mg/mL、1.359mg/mL。4利用琼脂糖扩散实验定性检测HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii对伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的活性，均可看到明显的抑菌圈，浓度为120ug/mL的抗菌肽抑菌圈直径与阳性对照卡那霉素无明显差异，浓度为2ug/mL的抗菌肽未见抑菌圈。5通过测定最低抑菌浓度（MIC）定量检测HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii对伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌的活性，对伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为8ug/mL、4ug/mL、4ug/mL，4ug/mL、4ug/mL、2ug/mL。6测定HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii对伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响，进行抗菌肽动力学研究，发现重组抗菌肽对伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长具有明显的抑制作用。研究结论：本研究利用pET-EI原核融合表达系统对HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii进行了基因工程表达，经密码子改造后的重组抗菌肽HβD-3i/HβD-3ii的表达量是原始序列HβD-3表达量的约12倍之多。对融合表达产物进行“ITC法”纯化蛋白，密码子改造的HβD-3i/HβD-3ii与原始序列HβD-3具有相似生物学活性，对金黄色葡萄球菌的活性强于伤寒沙门菌。表明利用pET-EI原核表达系统表达HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii是可行的，且因该纯化方法经济简便，为实现HβD-3/HβD-3i/HβD-3ii大规模生产奠定基础。