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背景:全球每年新发胃癌病例约100万例,其中47%的新发病例在中国,严重威胁人体健康和生命质量。幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori,H.pylori）是Ⅰ类致癌因子,目前据估计全球超过半数人口感染,而在我国各地自然人群中感染H.pylori的比例在41.35%-72.3%。其感染可导致胃粘膜发生慢性炎症,产生萎缩性胃炎,肠上皮化生甚至上皮内瘤变,这类癌前病变状态部分可发展为癌。因此,全面研究H.pylori感染导致胃癌的发病机制具有重要的科学价值和临床意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA）是一类长度大于200碱基的RNA分子,不编码蛋白,但具备复杂的生物学功能。越来越多的研究表明lncRNA的变异和异常表达能够导致包括肿瘤在内的多重疾病,但关于其在H.pylori致病过程中的作用,甚少报道。表观遗传（Epigenetics）是指DNA序列不发生变化,但基因表达却发生了可遗传的改变。目前广泛研究的表观遗传学机制主要包括DNA甲基化、非编码RNA、组蛋白修饰、染色质重构等。表观遗传修饰并非单一的调控机制,越来越多的研究表明,在肿瘤的形成过程中,存在着lncRNA对其他表观遗传方式的调控,形成表观遗传调控网络。在前期研究中我们收集了 H.poylori-和H.pylori+的胃癌组织,进行lncRNA微阵列芯片检测和DNA甲基化微阵列芯片检测,通过对两组芯片结果的交叉比对异常表达的lncRNA和异常甲基化基因的染色体位置,发现有14对lncRNA和甲基化基因位置接近,其中位于1 1号染色体的lnRNA NR 033122和VPS11位置最靠近,提示在H.pylori相关胃癌中lncRNA NR 033122可能通过表观遗传途径调控VPS11的表达。因此,本研究从H.pylori感染后引起的lncRNA异常改变入手,探究lncRNA对DNA甲基化的调控。目的:1.筛选H.相关胃癌中差异表达的lncRNA,验证关键lncRNA的表达;2.筛选H.pyori相关胃癌中异常甲基化的基因,通过与lncRNA进行交叉分析,选取与lncRNA具有潜在相关性的基因,并验证其甲基化水平;3.观察关键性lncRNA和异常甲基化基因对H.pylori相关胃癌表型的影响;4.探讨H.pylori相关胃癌中关键性lncRNA对基因DNA甲基化的调控机制。方法:1.随机选取手术切除的3对H.pylori+和H.pylori-胃癌组织,进行lncRNA芯片检测,筛选H.pyori作用下差异表达的lncRNA;2.取同样的胃癌组织样本,进行DNA甲基化芯片检测,筛选H.pylori作用下异常甲基化的基因;3.交叉比对lncRNA和甲基化芯片结果,分析可能参与表观遗传调控的lncRNA;4.用Real-time PCR检测60例胃癌和60例慢性胃炎组织样本lncRNA NR 033122的表达;焦磷酸测序检测VPS11启动子区甲基化水平,Real-time PCR和Western Blot检测VPS11 mRNA和蛋白表达;对lncRNA表达和VPS11甲基化水平、表达情况分别进行相关性分析;5.用H.pylori刺激胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、MKN-45、AGS,验证方法与临床样本验证相同;6.构建H.pylori感染的小鼠模型,分别于成功感染后2m、6m、12m处理小鼠取胃黏膜组织,Real-time PCR检测同源性lncRNA NM133226.2表达;焦磷酸测序检测VPS11启动子区甲基化水平,Real-time PCR检测VPS11 mRNA表达;7.构建lncRNA NR 033122的干扰siRNA和过表达质粒,转染进入SGC-7901、MGC-803和AGS细胞,通过Real time PCR和Western Blot检测转染效率,利用CCK-8和Transwell侵袭实验检测lncRNANR 033122对胃癌细胞增殖和侵袭的影响;8.构建VPS11的干扰siRNA和过表达质粒,转染进入SGC-7901、MGC-803和AGS细胞,通过Real time PCR和Western Blot检测转染效率,利用CCK-8和Transwell侵袭实验检测VPS11对相关胃癌细胞增殖和侵袭的影响;9.用lncRNANR 033122的干扰siRNA和过表达质粒转染胃癌细胞,检测VPS11启动子区甲基化、VPS11 mRNA和蛋白表达、DNMTs蛋白表达;10.裸鼠成瘤和尾静脉转移实验观察lnc RNA NR 033122和VPS11在体内对胃癌细胞的影响;11.生物信息学分析lnc RNANR 033122下游潜在的靶基因,并验证;12.转染lncRNANR 033122高表达质粒,通过RNA pulldown实验检测lncRNA NR 033122 与 NF-κB 的结合;13.H.pylori刺激胃癌细胞,通过co-IP检测NF-κB与DNMTs的结合。结果:1.通过高通量lncRNA芯片检测,在H.pylori相关胃癌组织样本中筛选出46个表达上调的lncRNA,80个表达下调的lncRNA。2.通过高通量DNA甲基化芯片检测,在H.pylori相关胃癌组织样本中筛选出86个高甲基化基因,62个低甲基化的基因。3.通过交叉比对lncRNA和DNA甲基化芯片结果,发现14对位置接近的lncRNA和异常甲基化基因,选取lncRNANR 033122和VPS11进行后续研究。4.临床样本验证发现:胃癌组织样本中lncRNANR 033122和VPS11表达降低（P<0.01）;H.pylori感染可以使两者表达进一步下降（P<0.01）;胃癌组织样本VPS11启动子区甲基化水平高于慢性胃炎组织（P<0.01）,H.pylori感染可以提高VPS11启动子区甲基化水平（P<0.01）。lncRNA NR 033122的表达与VPS11启动子区DNA甲基化水平呈负相关,与VPS11表达呈正相关。5.细胞模型验证发现:H.pylori感染后胃癌细胞SGC-7901、MGC-803、MKN-45、AGS中lncRNA NR 033122表达均下降（P<0.01）;各细胞系H.pylori感染后VPS11启动子区各位点甲基化水平均增高（P<0.01）,VPS11 mRNA和蛋白表达均下降（P<0.01）。6.动物模型验证发现:H.pylori感染后小鼠胃黏膜中lncRNA NM 133226.2表达下降（P<O.01）;H.pylori组VPS11启动子区甲基化水平较Control组增高（P<0.01）,VPS11 mRNA 表达下降（P<0.01）。7.低表达lncRNANR 033122的胃癌细胞增殖和侵袭能力增强,而上调lncRNA NR 033122表达后,能逆转H.pylori对胃癌细胞的促进作用。8.低表达VPS11的胃癌细胞增殖和侵袭能力增强,而上调VPS11表达后,能逆转H.pylori对胃癌细胞的促进作用。9.低表达lncRNA NR 033122的胃癌细胞VPS11启动子区甲基化水平增高,mRNA和蛋白表达下降,DNMT1和DNMT3a表达上调;lncRNA NR 033122高表达后,结果相反。10.低表达lncRNANR 033122和VPS11在裸鼠体内均能促进胃癌细胞增殖（P<0.01）,对转移能力影响不明显。11.生物信息学分析发现NF-κB是lnc RNA NR 033122下游潜在的靶基因,H.pylori.感染能诱导NF-κB表达,促使其入核活化。12.转染 lncRNA NR033122 高表达质粒,RNA pulldown 证实 lncRNA NR 033122 与 NF-κB 的结合。13.H.pylori刺激胃癌细胞,co-IP证实NF-κB可以和DNMT1、DNMT3a结合。结论:1.H.pylori感染可以下调LncRNANR033122表达,LncRNANR 033122在胃癌中发挥着抑癌基因的作用。2.H.pylori感染可以通过超甲基化途径下调VPS11的表达,VPS11在胃癌中发挥着抑癌基因的作用。3.LncRNANR 033122与VPS11在染色体上位置接近,LncRNANR 033122参与对VPS11的表观遗传调控。4.在H.pylori相关胃癌中,下调的LncRNA NR033122可激活下游靶基因NF-κB,活化的NF-κB能招募DNMT1和DNMT3b,导致VPS11启动子区发生甲基化。