丝状支原体山羊亚种PG3株LppA基因的原核表达及免疫学特性研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:f_m_q
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山羊传染性胸膜肺炎(Contagious Caprine Pleuropneumonia, CCPP)被世界动物卫生组织列为B类传染病,为山羊特有的急性或慢性高度接触性传染病。本论文将丝状支原体山羊亚种PG3株复活后大量培养,获得其基因组。并以其为模板,用一对特异性引物(上游引物3’端和下游引物5’端引入Bam H Ⅰ和XhoⅠ酶切位点)扩增LppA基因。由于LppA基因中含有一个密码子TGA在支原体中编码色氨酸而在原核表达系统中作为终止密码子,因此又设计出一对突变引物将TGA同义突变成TGG后构建克隆质粒,将含目的片段的克隆质粒和原核表达载体pET-32a(+)经双酶切后构建表达重组质粒PET-32a-LppA,将PET-32a-LppA转入宿主菌后进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,证明所表达的融合蛋白的蛋白分子量大小为64kDa, Western-blot分析表明,该蛋白具有免疫反应性;将融合蛋白纯化后对小鼠分别进行三次免疫,采血收集各个免疫阶段的血清。应用ELISA方法测定小鼠血清中是否产生相应的LppA抗体。结果表明:经三次免疫后小鼠血清中均产生了相应的LppA抗体,其中融合蛋白免疫组与空白对照组相比差异极显著(P<0.01);通过吞噬调理试验检测融合蛋白是否能增强吞噬调理作用,试验结果表明:融合蛋白全血的杀菌能力与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。以上结果说明,本研究成功地突变、克隆并表达了丝状支原体山羊亚种PG3株的LppA基因,并成功的构建了重组表达质粒PET-32a-LppA,表达产物经过免疫学特性分析表明重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。为研制预防山羊传染性胸膜肺炎的基因工程亚单位疫苗提供了实验依据。
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