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研究背景：膀胱肿瘤是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,是一种直接威胁患者生存的疾病。在全世界范围内膀胱肿瘤的发病率在男性占全身肿瘤的第8位,在女性为第25位。男女患病率比约为3：1。据统计,2011年世界膀胱癌新发病例数达到69250例以及因患膀胱癌死亡人数居总体因肿瘤死亡人数的第8位。在我国,膀胱肿瘤是泌尿生殖系统最常见的肿瘤,其发病率死亡率均居泌尿系统首位,而且近年来有不断增长的趋势。组织学角度上,膀胱癌大多数为膀胱尿路上皮癌,约占90%。然而临床上常根据肿瘤细胞的浸润深度及是否存在转移,将膀胱癌分为两种类型,即非肌层浸润性膀胱癌(Tis, Ta, T1)和肌层浸润性膀胱癌(T2以上)。非肌层浸润性膀胱癌具有多相群的特点,包括了从良性的肿瘤,到极少发生进展的非浸润性的乳头状瘤,以及到乳头状生长的侵袭粘膜下层的肿瘤。而肌层浸润性膀胱癌恶性程度极高,其特点是侵袭力极强,可向周围组织器官局部浸润性生长,甚至可通过淋巴管及血液等途径向远处发生转移。目前对膀胱肿瘤的诊断主要是依赖膀胱镜检查和病理学活检,但膀胱镜检查是一种有创性检查,会给患者造成一定的痛苦,病理学活检有时也可因取材失败而导致误诊。复发率极高是膀胱癌的特征之一,临床上初发的膀胱癌患者中,约70%的肿瘤是非肌层浸润性膀胱癌,在行保留膀胱的肿瘤切除术(主要是经尿道膀胱肿瘤电切术)后,即使按疗程定期行膀胱灌注化疗,仍有10%-40%复发率,大部分还会出现分级、分期的进展或者发生转移,从而丧失根治手术的机会。其余约30%的肿瘤是肌层浸润性膀胱癌,这部分患者即使接受根治性膀胱全切手术,术后仍有50%左右患者最后会死于肿瘤引起的远处转移。也就是说,不论行经尿道膀胱肿瘤电切术,还是行膀胱全切术,术后都有一定复发率,且随着每次复发,肿瘤的恶性程度也不断升高,最终发生肿瘤转移。而且除了手术治疗外,放化疗均有一定的效果,但是一般预后较差,极易复发及出现骨转移、肺转移等多发转移。因此寻求新的肿瘤诊断、治疗及预后判断指标成为当前医学研究重中之重。Nodal蛋白是TGF-β超家族的成员,胚胎形成的重要调节因子,且其信号通路在胚胎发育过程中主要影响中内胚层诱导和胚胎左右不对称发育。近年来多项研究发现,Nodal蛋白在黑色素瘤、乳腺癌、神经胶质瘤等多种肿瘤中存在高表达,并且与肿瘤增殖、侵袭及转移密切相关。但Nodal蛋白在膀胱肿瘤中的表达目前尚未完全阐明,且该蛋白与膀胱肿瘤生物学行为和临床参数关系的研究国内外未见报道。我们实验研究的目的是在于研究Nodal蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达,并初步探讨其在膀胱尿路上皮癌发生、发展及预后中的意义。研究目的：观察胚胎成形素Nodal在正常膀胱粘膜组织和膀胱尿路上皮癌(下称膀胱癌)组织中的表达情况,初步探索Nodal与膀胱癌发生、发展的关系。研究方法：1、收集手术中切出的膀胱癌组织及其对应的癌旁组织,样本取自湖北省荆州市中心医院2009年8月至2010年8月的膀胱癌组织17例及6例对应的癌旁正常组织,17例膀胱癌病理分级：I级5例、II级7例、III级5例；TNM分期：Ta期7例、TI期6例、T2-T4期4例肿瘤组织均经病理证实,所有患者术前未接受化疗或放疗。2、采用免疫组化方法检测膀胱尿路上皮癌组织及其对应的癌旁正常膀胱组织的Nodal蛋白表达切片脱蜡和水化后清除内源性过氧化物酶并进行抗原修复,每张切片上滴加50uL5%羊血清封闭液,室温孵育10分钟；倾去血清,加入适当量一抗工作液,4℃冰箱孵育过夜,PBS缓冲液(PH7.4)洗涤3次×5min；除去PBS液,每张切片加50uL生物素标记的羊抗小鼠二抗,室温下孵育20min,孵育后PBS冲洗3次,每次5min；甩去PBS液,滴加50uL链霉菌抗生物素-辣根过氧化物酶溶液,室温孵育40min,PBS冲洗5min×3次；DAB显色3-5min,显微镜下控制,自来水冲10min-15min终止反应,苏木素复染约3min,梯度酒精脱水和二甲苯透明后中性树胶封片。结果判断由两个独立的病理医生无相关样本临床资料的信息分析,出现结果不一致时重新判片,直至达成一致意见。结果判定的标准：以细胞浆出现棕黄色颗粒的细胞定为阳性细胞,每张切片采用盲法随机观察10个高倍镜视野(×400),结果采用半定量计分方法,根据细胞染色强度(A)和染色细胞所占的比例(B)两者乘积来判定。3、采用RT-PCR方法检测膀胱尿路上皮癌组织及其对应的癌旁正常膀胱组织由Nodal mRNA表达水平,并分析Nodal mRNA表达与膀胱尿路上皮癌病理分级及临床分期的关系GenBank上查找NodalmRNA序列,并应用在线引物设计软件Premier Primer5.0和Oligo6设计相关引物。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。按照Trizol Reagent说明书将总RNA提取后,按70℃5min,37℃5min,42℃60min,70℃10min进行反转录合成cDNA,加4uL反转录DNA产物于25uLPCR反应体系中,94℃5min,94℃30s,55℃45s,72℃1min,循环36次。选择β-actin为PCR内参。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析后,计算待测指标与B-actin A值的比值。应用SPSS13.0软件进行统计学分析比较膀胱尿路上皮癌生物学行为与Nodal mRNA表达之间的关系,P<0.05为差异具有统计学意义。4、采用Western Blot方法检测膀胱尿路上皮癌组织及其对应的癌旁正常膀胱组织中Nodal蛋白表达水平,并分析Nodal蛋白表达与膀胱尿路上皮癌病理分级及临床分期的关系提取各标本总蛋白并定量,8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质后转膜,37℃下5%脱脂奶封闭1h,一抗为小鼠抗人Nodal单克隆抗体(1：1000),4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2h,洗膜后ECL显影,暗室压片曝光。所有实验重复3-5次。所得到的蛋白条带经扫描后计算各条带与内参β-actin吸光值(A值)的比值,此代表各标本中Nodal蛋白表达含量。采用SPSS13.0软件进行统计学分析膀胱尿路上皮癌生物学行为与Nodal蛋白表达之间关系的关系,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果：1、免疫组化结果提示：正常膀胱组织并不表达Nodal蛋白(正常组织中未见棕黄色着色)；膀胱肿瘤组织开始不同程度表达Nodal蛋白,具体表现为肿瘤细胞胞浆内可见棕黄色的阳性颗粒,细胞膜及细胞核均未见明显阳性着色；且随着病理分级的提高肿瘤组织已失去正常细胞排列形态,细胞排列杂乱无章,同时胞浆内染色颗粒着色更强,说明此时Nodal蛋白强表达。2、Western Blot法和RT-PCR法检测结果表明正常膀胱组织中没有检测到Nodal蛋白、mRNA的表达,17例肿瘤组织均存在Nodal蛋白及mRNA的阳性表达。3、通过成像系统对各条带吸光值进行分析后发现,Nodal蛋白、mRNA表达强弱与肿瘤病理分级、临床分期有关,且呈正相关,即肿瘤分级及分期越高,Nodal蛋白及基因表达越强烈,Ⅲ级>Ⅱ级(P<0.05)>Ⅰ级(P<0.01),T2-T4期>T1期>Ta期(P均<0.05)。结论：1、膀胱癌组织中Nodal蛋白、mRNA呈高表达,而对应的癌旁正常膀胱组织中未检测到Nodal蛋白、mRNA表达。2、Nodal蛋白、mRNA表达强弱与膀胱癌病理分级及临床分期有关,且呈正相关性,提示Nodal可能参与了膀胱癌的发生、发展过程。3、Nodal可能在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用,而且有望成为膀胱癌早期检测及治疗的重要靶点。