嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus,A.caldus)属革兰氏阴性菌,严格的化能自养,可氧化利用丰富多样的还原性无机硫化物和单质硫,广泛应用在生物冶金、煤的脱硫和含硫废水的处理等工艺中。硫代谢是A.caldus的核心能量系统,也是其产业应用的基础。A.caldus的单质硫代谢是一个由细胞外到细胞内的复杂氧化过程:首先,细胞通过运动吸附到单质硫表面;然后对单质硫进行活化将胞外单质硫转化成活性硫,进入细胞周质空间并被氧化,产生不同类型的硫化合物;接着这些硫代谢中间产物通过硫转运系统进入细胞质,被进一步氧化。因此,单质硫的氧化过程是由多种系统参与的、逐步氧化的过程。A.caldus等嗜酸性硫杆菌硫代谢过程中硫氧化酶的发掘与鉴定工作在过去几年已经得到广泛的研究,但是嗜酸性硫杆菌对单质硫的吸附过程、胞内硫转运过程的研究鲜有报道,相关知识的缺失和不足,限制了对嗜酸性硫杆菌完整硫代谢过程的认知,也不利于硫代谢工程菌株的构建及其产业应用。因此,本论文针对嗜酸性硫杆菌硫代谢过程中的细胞吸附过程和胞内硫转运系统进行了系统研究。(一)鞭毛介导的细胞运动对A.caldus 单质硫吸附的影响:1.鞭毛基因簇特征及鞭毛合成调控蛋白(RpoF)的转录规律:A.caldus中鞭毛基因簇的生物信息学分析。分析发现,A.caldus中所有的鞭毛合成相关基因在染色体上形成一个庞大完整的基因簇,涉及基因近40个,约占整个基因组ORFs(Opening read frames)的2%。比较基因组学系统分析了Acidithibacillia中鞭毛基因簇的同线性关系以及与其他具有单生鞭毛的异养微生物的异同。归纳统计分类学特征时还发现,在Acidithiobacillus的七种菌株中,具有鞭毛的菌种都含有Sox系统,推测二者在Acidithibacillia的进化上可能同时发生,暗示着鞭毛与硫代谢有重要的联系。另外,在对RpoF调控基因的启动子序列分析时,并没有发现其在异养菌中相似的特征序列,RpoF的系统发育分析表明,它在进化上与异养菌有较大差异,暗示着RpoF具有物种特异性。2.鞭毛在A.caldus能量代谢中的作用及RpoF的调控功能研究:A.caldus中rpoF基因的功能研究。基于同源重组原理,利用无标记基因无痕敲除技术,敲除A.caldus基因组上鞭毛合成调控因子RpoF基因,并以广宿主质粒pJRD215为骨架,构建了 rpoF基因的过表达和回补菌株,研究了它们对A.caldus鞭毛及硫吸附的影响。此外,在转录组水平上研究了 rpoF对细胞鞭毛合成基因及其它生命活动的影响。RNA-seq结果显示rpoF还参与了细胞能量代谢、DNA修饰、pili合成和第二信使c-di-GMP生成等过程,对细胞的生命活动起到全局性的调控作用。此外,根据先前的研究结合转录组数据,提出了 A.caldus中鞭毛的合成组装的级联调控模型。(二)Dsr系统在A.caldus胞内硫活化转运中的功能:1.A.caldus中Dsr系统特征分析:本文以DsrE2A和TusA两个小分子硫载体为切入点,对A.caldus胞内硫转运蛋白基因簇进行了生物信息学分析。在A.caldus基因组上发现了dsrE3A-tusA-rhd-hdr基因簇,这是一个不完整的Dsr基因簇。通过BlastP和系统发育分析了A.caldus中硫转运相关蛋白的特征。同时,通过RT-qPCR研究了这些基因在硫代谢过程中的转录变化及基因簇的共转录关系。2.A.caldus细胞内硫转运蛋白功能的研究研究了硫转运蛋白基因缺失或过表达对A.caldus硫代谢中的影响。dsrE2A和orf1004两个基因的敲除对单质硫的代谢影响不明显,而tusA基因的缺失,对单质硫的代谢产生了显著的抑制作用。在以K2S4O6为能源时,除△1004没有表现出差异外,△dsrE2A和△tusA均与野生型的生长差异显著。缺失dsrE2A反而促进了 K2S406的代谢,而tusA的缺失使细胞积累胞外硫,严重阻碍了 S4O62-的氧化。另外,△dsrE2A和△tusA两个敲除株对Na2S2O3的代谢有明显的促进作用。与敲除相对应,dsrE2A的过表达对单质硫的氧化有微弱的促进作用,对S4O62-的代谢则具有明显的抑制,而其同源基因orf0418的过表达对单质硫虽然没有明显的影响,但其对S4062-的氧化有显著的促进作用,细胞几乎没有生长停滞期就直接开始生长。同理,tusA的过表达也与其敲除相呼应。然而orf1004的过表达菌株和敲除菌株一样,在本实验条件下,对细胞的硫代谢没有产生明显的影响。研究了硫转运蛋白DsrE2A和TusA上的关键氨基酸位点。BlastP分析发现,小分子硫载体蛋白中都含有十分保守的Cys残基,为了深入研究DsrE2A和TusA的功能,对其关键的Cys氨基酸位点进行突变,以pJRD215为骨架,构建相应基因的突变载体,在利用接合转移的方法将其导入对应的突变株中,通过体内实验研究其对不同还原性硫化物的影响。研究表明,DsrE2A蛋白C-端末尾的第117位的Cys和倒数第二个Cys(第101位)是该蛋白两个关键氨基酸位点。而TusA蛋白N-端第15位的Cys对其功能至关重要,突变后,细胞的生长达到△tusA水平。对dsr基因簇其它基因进行了初步探索。构建了相关基因(hdrs,seos和rhds等)的过表达菌株,研究了它们对不同硫化物氧化的影响。发现这些基因的过表达对细胞单质硫的氧化影响较小,大部分基因的过表达甚至表现出与野生型几乎一致的生长趋势,但对S4062-氧化均产生了不同程度的影响。说明这些基因确实参与了 S4062-的转运与氧化。