转移是恶性肿瘤致死的重要因素。研究肿瘤转移机制对肿瘤转移的早期诊断和治疗具有重要的意义。肿瘤转移的方式主要有淋巴道转移、血道转移和种植转移。50%以上的肿瘤通过淋巴道转移,但肿瘤转移的发生机制尚有待进一步研究。研究表明,肿瘤转移不仅与机体微环境有关,还与肿瘤细胞自身特性密切相关。前胶原Ⅷ型(procollagen,type VIII,COL8A1),属于细胞外基质蛋白。胶原蛋白α- 1 (八)链前体(内皮胶原蛋白)至今发现人体胶原蛋白已有19种,带有前肽的三股螺旋胶原分子称为前胶原,水解后成为胶原分子。COL8A1是一种非纤维的短链胶原蛋白,它可以调节,增殖和依附各种细胞。在肿瘤细胞中COL8A1表达升高,可能与肿瘤细胞的增殖能力呈正比。同时,COL8A1表达升高可能是肝脏来源的肿瘤细胞的标记分子之一。右旋柠烯(d-limonene)是从中药橘皮中提取的有效单体成分,属于天然单萜烯类化合物。右旋柠烯化学名为1-甲基-4-异丙基环己[1-methyl-4-(1-methyl-ethenyl)-, (4R)-],分子式为C10H16,分子为136.32,属于一种单萜烯类化合物,多来源于芸香科植物柑橘、柠檬、酸橙等挥发油中。既往的大量试验证明,右旋柠烯具有抗癌活性,对于化学诱导的啮齿类动物胃癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌及皮肤癌等多种肿瘤具有预防和治疗作用,其作用机制包括直接对肿瘤细胞的细胞毒作用、诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞内法尼基蛋白转移酶的活性和水平。体外试验也发现,右旋柠烯对肝癌、胰腺癌、胃癌、白血病等多种恶性肿瘤细胞具有细胞毒作用,并通过多种信号途径,诱导肿瘤细胞的凋亡。右旋柠烯还可以抑制肿瘤微血管和微淋巴管形成,降低MVD和LMVD,抑制肿瘤转移的发生。Hca细胞是从615小鼠腹水型肝癌细胞株H22中筛选而出,具有特异性经淋巴道转移的能力,其中高转移株Hca-F细胞接种615小鼠足垫后,有80%的淋巴道转移力,而低转移株Hca-P细胞的淋巴结转移率为30%。因此,Hca细胞是研究淋巴道转移机理的较好模型。但其具体机制迄今尚不清楚。本试验采用的小鼠肝癌细胞Hca-F、Hca-P、Hepa1-6具有高、低及无淋巴道转移潜能的特性,以正常小鼠肝细胞IAR-20为模型,以SPF级C57L、615小鼠为动物实验模型。分析COL8A1在小鼠肝癌细胞中的表达情况;通过RNA干扰技术特异性使Hca-F细胞中COL8A1表达下调时对肝癌细胞淋巴道转移的影响;将cDNA转染到Hepa1-6细胞中,稳定过表达COL8A1时对肝癌细胞成瘤性的影响;右旋柠烯对COL8A1调控肿瘤转移及成瘤性的影响。旨在建立COL8A1与肿瘤转移的相关性,为抗肿瘤淋巴道转移的药物设计提供依据。本文的主要工作分三部分:1. COL8A1在小鼠肝癌细胞中的表达通过RT-PCR、免疫印迹(Western blot)分析Hca-F、Hca-P、Hepa1-6和IAR-20细胞中COL8A1的表达情况。结果显示,COL8A1在Hca-F、Hca-P、Hepa1-6和IAR-20细胞中均有表达,且Hepa1-6细胞的表达强度明显低于Hca-F和Hca-P细胞。小鼠正常肝细胞株IAR-20中检测到少量COL8A1的表达。以上结果表明,COL8A1主要表达于具有淋巴道转移潜能的细胞表面;COL8A1高表达可能与肿瘤的转移有关,而在无转移潜能的小鼠肝癌细胞中COL8A1低表达。2. COL8A1表达调控在小鼠肝癌细胞淋巴道转移及成瘤性的作用2.1应用RNAi技术下调COL8A1基因表达,观察Hca-F细胞经淋巴道转移能力的变化。结果显示,Hca-F/siRNA细胞中被沉默后的COL8A1的mRNA表达下调明显,而两对照组(未给予RNA干扰处理的、RNA干扰对照组)COL8A1 mRNA的表达无明显变化。Western blot分析进一步验证了上述细胞中COL8A1的蛋白质表达水平。2.2用RNA干扰Hca-F细胞的COL8A1基因后,用MTT方法检测Hca-F细胞的增殖活性,设两对照组(未干扰对照组:未干扰的Hca-F细胞,干扰对照组:对照siRNA干扰的Hca-F细胞)。结果显示,COL8A1表达下调抑制Hca-F/siRNA细胞体外增殖能力,日趋下调的生长率曲线,而干扰对照组的细胞生长率曲线则平缓趋势。2.3采用基质胶体外试验观察COL8A1表达下调抑制Hca-F/siRNA细胞体外侵袭能力。结果显示,未给予RNA干扰处理的对照组为(71±8),RNA干扰对照组为(69±9),而Hca-F/siRNA细胞穿过基质胶的数目(20±5)明显减少。2.4采用体内淋巴结转移试验观察COL8A1表达下调抑制Hca-F/siRNA细胞体内淋巴结转移能力。结果显示,平均转移淋巴结的重量干扰组明显减轻, COL8A1 siRNA为0.26±0.05g,对照siRNA为0.63±0.07g,Hca-F为0.68±0.06g。2.5采用其低表达COL8A1的Hepa1-6细胞,将已构建的COL8A1-pEGFP-N2质粒转染至低表达COL8A1的Hepa1-6细胞,观察cDNA转染上调COL8A1基因表达。结果显示,稳定转染后Hepa1-6/ COL8A1细胞中高表达COL8A1,而其余两对照组细胞低表达COL8A1。表明本试验采用的稳定转染方法是可行的并且可靠有效的。2.6对Hepa1-6细胞的COL8A1基因过表达后,用MTT方法检测细胞的增殖活性,观察COL8A1过表达上调Hepa1-6/ COL8A1细胞体外增殖能力。结果显示,COL8A1过表达上调Hepa1-6/ COL8A1细胞体外增殖能力,生长率曲线日趋上调,而对照组的细胞生长率曲线则平缓趋势。2.7采用体外侵袭试验观察COL8A1过表达对Hepa1-6/ COL8A1细胞体外侵袭能力的影响。结果显示,稳定表达的COL8A1能促进Hepa1-6/ COL8A1细胞体外侵袭能力及在肿瘤的转移中发挥重要作用。2.8采用体内成瘤试验观察COL8A1过表达对Hepa1-6/ COL8A1细胞体内成瘤性的影响。结果显示,稳定表达的COL8A1促进Hepa1-6/ COL8A1细胞的成瘤能力。3.右旋柠烯对COL8A1调控肿瘤转移、成瘤性的影响采用抗肿瘤药物右旋柠烯分别处理上述细胞模型,观察上述细胞的药敏性,为肿瘤的药物治疗提供新靶点。抑制COL8A1表达增加Hca-F/siRNA细胞对右旋柠烯的药物敏感性;右旋柠烯对COL8A1调控肿瘤细胞体内淋巴结转移能力的影响。COL8A1过表达下调Hepa1-6/COL8A1细胞对右旋柠烯的药物敏感性;右旋柠烯对COL8A1调控肿瘤细胞体内成瘤性的影响。通过上述试验得出结论:1. COL8A1在小鼠肝癌细胞Hca-F,Hca-P和Hepa1-6中均有表达,且Hca-F细胞的表达强度明显高于Hca-P和Hepa1-6细胞。提示COL8A1主要表达于恶性肿瘤细胞表面,是恶性肿瘤细胞行为的主要介导者。2 .COL8A1的表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭密切相关。3.抑制COL8A1表达能增强Hca-F/siRNA细胞对右旋柠烯的药物敏感性;相反,COL8A1过表达抑制Hepa1-6/COL8A1细胞对右旋柠烯的药物敏感性。右旋柠烯对COL8A1调控肿瘤转移、成瘤性的起着重要作用。同时也为抗肿瘤转移的药物设计提供有价值的试验依据和线索。