干酪乳杆菌LCR 6013降解亚硝酸盐的途径及其亚硝酸盐还原酶的表征

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亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质,且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症,因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。笔者研究组于前期筛选到干酪乳杆菌鼠李糖亚种LCR6013(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus LCR6013)能降解亚硝酸盐,本文研究了白菜发酵体系和MRS体系中LCR6013降解亚硝酸盐的影响因素和规律;利用ECD-气相色谱法研究了LCR6013降解亚硝酸盐的N2O及降解途径;还利用细胞组分法研究了LCR6013细胞中亚硝酸盐还原酶(nitrite reductases,简称NIRs)的初步定位,并研究了亚硝酸盐的部分性质,主要结果如下:在白菜发酵过程中,与自然发酵组对比,接种LCR6013组能够有效降解亚硝酸盐。发酵过程的pH变化规律表明,发酵3d后两组的pH都约为3.00,前者降解亚硝酸盐的速率比对照组快,在蔬菜发酵过程中,LCR6013降解亚硝酸盐不是主要源于酸的作用;当NaCl和VC浓度分别为为0.75%和0.02%时,LCR6013降解亚硝酸盐的浓度分别为9.25μg/mL、9.70μg/mL;FOS浓度为0.1%时,LCR6013的OD600最高为3.05。但是FOS并不能提高LCR6013降解亚硝酸盐能力,本研究中LCR6013最多可降解亚硝酸盐的量约为50.00μg/mL。采用ECD-气相色谱法研究了MRS体系中顶空空气中的气体组分N2O浓度的变化规律,当亚硝酸盐初始浓度为10.00μg/mL时,N2O体积百分比含量为28.8110-6,CK1和CK2均没有N2O吸收峰。实验组中TAN浓度与对照组没有显著差异,LCR6013降解亚硝酸盐产物不含NH4+,因此,LCR6013通过反硝化作用降解亚硝酸盐,可能的途径为NO2-NO N2O N2。LCR6013细胞组分中周质粗酶和细胞质酶都显示了亚硝酸盐降解活性,其NIRs酶活分别为312.64U和124.69U,前者是后者的2.5倍,在MRS体系中LCR6013降解亚硝酸盐是源于细胞内NIRs的作用,且主要位于细胞周质。LCR6013的NIRs粗酶依次经过阴离子DEAE Sepharose CL-6B和葡聚糖凝胶G-100两种层析柱纯化后,NIRs酶活提高了35.08倍;与硫酸铵盐析法和无水乙醇沉淀法相比,PEG20000浓缩法操作简易,浓缩后NIRs的酶活高;SDS-PAGE电泳表明LCR6013中NIRs单体的相对分子质量为41.43kD;串联质谱法测序显示该酶的质谱性质与Bacillus cereusAH187中的鞭毛蛋白相近。
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