布鲁氏菌P39抗原糖基化与非糖基化免疫原性差异的分析

来源 :吉林农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:gift19852003
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患的传染病,在世界各地都广泛流行,在发展中国家尤为严重。目前,控制布鲁氏菌病的主要手段是检出捕杀和免疫动物,然而尚无有效的商品化人用疫苗,而动物疫苗多为弱毒苗,具有一定的毒性和致病力,难与自然感染区分开。因此,开发安全有效的疫苗是控制布病的主要研究内容。P39蛋白是羊布鲁氏菌免疫保护候选抗原蛋白,本文以毕赤酵母为宿主表达P39蛋白,对其进行糖基化修饰,探讨其糖基化修饰对重组蛋白免疫原性的影响,为布鲁氏菌新型疫苗的研制奠定基础。方法:对布鲁氏菌优势抗原蛋白P39基因进行克隆,并构建真核表达载体pPICZαA-P39,电转化法转化GS115感受态细胞,Zeocin抗性筛选高拷贝数转化子,优化重组蛋白的表达条件,通过亲和层析方法对目的蛋白进行纯化,分子筛进一步纯化,BCA法检测蛋白浓度,液相色谱法检测其纯度,Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定。利用PNGaseF糖苷酶对重组蛋白进行N端糖链的释放,PAS糖原进行染色,并利用核磁共振氢谱对重组蛋白的糖基化修饰进行分析,确定其糖基化程度。通过巨噬细胞对糖基化蛋白的吞噬作用研究糖基化后的蛋白对细胞识别的影响,通过免疫小鼠实验,检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平、细胞因子分泌水平、IgG特异性抗体水平等实验研究其免疫原性的变化。通过Western Blot检测细胞表面受体TLR-2、MyD88、TRAF6、TLR-4表达情况,探讨蛋白糖基化修饰对免疫信号分子的影响及糖基化影响免疫原性的机制。结果:1.对P39抗原蛋白在毕赤酵母中分泌表达,优化发酵条件发现在pH 6、甲醇诱导浓度为1%、磷酸盐浓度为0.02 M的条件下,诱导时间72h可获得蛋白5.05g/L。亲和层析法对目的蛋白进行纯化,高效液相检测纯化后蛋白纯度可达93.77%。Western blot免疫印迹法对目的蛋白进行鉴定,确定其分子量为45 kDa,与P39抗原蛋白相符。2.利用PNGaseF糖苷酶对重组P39蛋白进行水解,结合核磁共振氢谱结果表明,毕赤酵母表达的P39抗原蛋白被糖基化修饰,且糖基化修饰类型为O-糖基化。3.将毕赤酵母表达的重组蛋白免疫小鼠,MTT法检测脾淋巴细胞增殖结果发现,重组P39蛋白和原核P39蛋白均可显著促进脾淋巴细胞的增殖,但重组后的P39蛋白促脾淋巴细胞增殖的作用明显高于原核P39蛋白。检测小鼠血液中特异性IgG抗体变化发现,在免疫小鼠4-6周的时间内均能检测到较高水平的抗体IgG,真核表达的P39蛋白IgG抗体表达水平在5周时能达到峰值,且峰值略高于原核P39蛋白。通过检测细胞上清中细胞因子的分泌水平结果发现,重组的P39蛋白刺激细胞产生IFN-γ、IL-2细胞因子的水平高于原核蛋白组,说明重组的P39蛋白可能会更好的激活Th1型细胞免疫水平。4.巨噬细胞吞噬荧光标记的重组蛋白和原核蛋白,结果表明巨噬细胞对重组P39蛋白的捕获吞噬作用明显,且用时较短,说明重组的P39蛋白更易被巨噬细胞识别捕获。上述结果说明糖基化修饰后的蛋白其免疫原性明显高于未修饰蛋白。Western Blot检测细胞表面各类受体表达结果表明,毕赤酵母重组的P39蛋白与原核表达的P39蛋白均可引发细胞表面受体TLR-2、TRAF6、TLR-4表达,相对原核P39蛋白,糖基化蛋白可提高TLR-4受体及TRAF6信号分子的表达,说明糖基化的修饰后的蛋白可诱发机体产生部分天然免疫,可能是通过TLR-4受体,调节TRAF6信号途径。结论:通过对小鼠免疫原性的初步探索,研究发现真核P39蛋白和原核P39蛋白都可以刺激机体产生较强的免疫反应,能分泌大量的IFN-γ细胞因子,有效促进细胞免疫水平,脾淋巴细胞增殖实验发现糖基化修饰后的P39蛋白能显著促进淋巴细胞的增殖,且糖基化修饰的蛋白免疫后的小鼠抗体水平以及细胞因子水平均高于原核P39蛋白,糖基化修饰能提高P39蛋白的免疫保护力,可能是诱导了TLR-4受体信号途径,增强天然免疫水平。这为糖修饰P39蛋白作为布鲁氏菌疫苗候选抗原奠定了实验基础。
其他文献
为了促进学生自主学习能力的提升,文章首先阐述了小学语文教学现状,然后提出了翻转课堂在小学语文教学中应用的优势,最后从课前自学阶段、课中教学阶段、课后复习阶段提出了
2017年11月14日,“赤泥等多固废协同利用理论及其在路面基层材料中的应用”项目鉴定会在京召开。由北京科技大学、中色十二冶金建设有限公司承担的“赤泥等多固废协同制备路面
分析了世界石油石化业当前的宏观形势,指出存在着大宗石油石化品生产消费重心东移、市场回暖、产业结构调整继续深入进行、酝酿着新的技术突破、可持续发展越来越受到关注等5
目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(NaB)对子宫内膜癌细胞株HEC-2B增殖及N-myc下游调节基因1(NDRGl)蛋白表达的影响。方法 采用MTT比色法检测不同浓度的NaB处理HEC-2B细胞
华亭煤矿作为华亭煤田的重要组成部分,该矿井地质条件较为复杂,开采过程中出现过多次冲击地压现象;虽然已采取大力度的冲击地压监测与防治一系列措施,取得一定成果,但是由于井田构造的复杂性,冲击地压频繁发生,因此对华亭煤矿冲击地压危险性评价和监测技术仍有待进一步地研究。论文以华亭煤矿冲击地压为研究背景,通过现场调研、动静载理论分析、模糊综合评价、多元监测信息等研究手段,分析研究了华亭煤矿冲击地压致灾机理,
黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种土传病害,传统的化学药物防治污染环境,长期施用会使病原菌产生抗药性导致防治效果下降,而生物防治以其安全无污染的特点深受人们的青睐,
<正>吉安县坚持把加强机关党建与扶贫工作有机结合,强化县直机关党员干部脱贫攻坚的责任担当,着力在抓队伍、优服务、建机制上下功夫,先后荣获"全国扶贫开发先进集体"、"江西
目的:观察描述原发性VC患者在显微镜下腹股沟外环下切口精索脉管系统的术中解剖结构特点。方法:本研究收集我院泌尿中心男科病区收治的158例(2017年1月2017年12月)原发性VC患者,全部符合手术适应症,给予选择全身麻醉显微镜下腹股沟外环下方1cm处行精索静脉结扎术。手术按三层法解剖结构进行操作。术中分别观察并记录提睾肌层、精索内筋膜下输精管层及精索内静脉层的动脉、静脉及淋巴管数目。结果:精索内
为了检验广义极性振幅技术(GPAT)的实用性,我们利用GPAT反演确定了49次实际地震的震源机制、矩震级和震源深度.为了检验GPAT对地方地震、区域地震以及远震的实用性,我们选用了
对某车型汽车座椅发泡海绵进行自然老化,研究海绵的挥发性有机物(VOC)随时间的变化情况,实验采用10L袋子热脱附法测试一年内挥发性有机物的变化情况,结果表明,座椅海绵的苯系