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禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)感染可引起禽类的肿瘤、生长障碍和免疫抑制,导致禽类生产性能的降低以及疫苗免疫的失败,对养殖业的危害巨大。REV既可以水平传播,又能垂直传播,还能污染弱毒疫苗造成大范围的扩散。因此,有必要建立检测弱毒疫苗和临床样品中REV的方法。本研究采用PCR方法扩增编码REV群特异性抗原p30的基因,分别克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1和pET-32a(+)。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导分别获得49kD和43.4kD的重组蛋白GST-p30与His-p30,经高亲和力的GST树脂和NI-NTA树脂纯化,以纯化的重组蛋白GST-p30免疫BALB/c小鼠制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合；以纯化的重组蛋白His-p30作为ELISA检测抗原筛选阳性克隆,经3-4次亚克隆,共获得8株可稳定分泌针对p30抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A10、2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2。经鉴定这8株单抗的ELISA效价可达1：6,400～1：204,800；单抗4D9和4G2的亚类为IgG3,其余6株单抗的亚类均为IgG1；Western-blotting结果显示单抗2G1、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2和12F2可与重组蛋白His-p30特异性反应；而单抗1A10、4G2、4D9、2-4D9、8G3、9F2口12F2则可与感染REV的DF1细胞产生特异性荧光。选取特异性和灵敏度都较高的单抗4D9进行纯化,并以此建立了检测REV的间接免疫荧光(IFA)试验。通过对IFA反应条件的优化,该IFA方法可有效检测出DF1细胞中感染的REV与禽白血病病毒和马立克氏病病毒则不产生交叉反应；对REV的最小检出量为1TCID50，即1TCID50的REV感染DF1细胞4天后即可检出；而12.5TCID50的REV感染DF1细胞24h后即可检出；与PCR方法检测结果的符合率可达100%。利用所建立的IFA方法对2011-2014年间江苏、山东、安徽、河北和北京等地送检的弱毒疫苗和临床样品进行检测。从120份弱毒疫苗样品中检出1株REV,而从300份临床样品中检到2株REV。对分离的3株REV进行gp90基因遗传进化分析,发现均为I型的毒株,与标准株REV-A、REV-T以及HA9901的亲缘关系都很近,均在同一分支内。