前言　　近年来肺癌发病率持续升高，已成为恶性肿瘤死因的第一位。而大部分肺癌患者死于肿瘤的转移和复发，因此发现肺癌侵袭、转移的关键靶点具有重要意义。　　Rsf-1与hSNF2H形成染色质重塑复合物RSF，在这个复合物中Rsf-1作为组蛋白分子伴侣调整复合物与DNA的结合活性，同时hSNF2H利用其ATP酶活性和解螺旋酶活性参与核小体的移动和DNA的解螺旋。RSF复合物动员核小体调节染色质的结构以适应各种生长信号和环境变化的需求。已报道这种核小体的改变也发生在其他ISWI复合物和SWI/SNF复合物中，且它在转录的激活或抑制，DNA的复制，细胞周期的进展中有一定作用。越来越多的证据表明染色质重塑参与调控细胞的恶性转化和肿瘤进展。有研究证实在多个肿瘤组织中包括卵巢癌、乳腺癌、膀胱上皮癌、结肠癌、胃腺癌、口腔鳞癌、非小细胞肺癌等Rsf-1异常过表达，且其高表达与增殖、侵袭转移相关参数及预后相关。提示Rsf-1在肿瘤的增殖、侵袭转移等方面起一定的作用。已有报道显示在有Rsf-1表达的卵巢癌，结肠癌，直肠癌，非小细胞肺癌细胞系中Rsf-1可促进肿瘤细胞的增殖。　　但是Rsf-1在非小细胞肺癌中的表达情况与预后的关系未见文献报道，其对肺癌细胞运动侵袭的作用及其作用机制还不清楚。本课题拟通过免疫组化，westernblot，Rsf-1siRNA，Transwell等方法研究肺癌组织及细胞系中Rsf-1的表达情况，探讨Rsf-1对肺癌细胞侵袭转移能力的影响及可能的机制和信号途径，为肺癌的诊断和治疗提供新的基因靶点。　　材料和方法　　1、组织来源　　具有完整随访资料的61例非小细胞肺癌及相应正常肺组织标本均来自2005年到2007年在中国医科大学附属第一医院实行手术的病人，所有标本经病理学检查确诊，并经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准及患者知情同意。组织经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。患者术前均未接受放化疗。随访时间截止至2012年5月。　　2、免疫组织化学染色　　将石蜡组织块切成4μm厚切片，脱蜡，水化，按S-P法说明操作。抗Rsf-1的单克隆抗体(1∶1000，Upstate，USA)，DAB显色，苏木素复染细胞核。同时以PBS代替—抗作为阴性对照。两名病理诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。结果判定:Rsf-1以细胞核染色为阳性细胞。根据阳性肿瘤细胞百分比:0％记为0分，1-5％记为1分，6-25％记为2分，26-75％记为3分，76-100％记为4分。同时根据染色强度:阴性或浅黄色记为0分，黄色记为1分，棕褐色颗粒记为2分。着色细胞数得分乘以着色强度得分为Rsf-1得分。我们将得分为0-3分记做Rsf-1低表达，得分为4-8分记做Rsf-1高表达。　　3、细胞培养与siRNA干扰　　HBE、A549、H1299、H460、H157、LK2细胞系从ATCC(Manassas，VA，USA)细胞库获得。PG-BE1(BE1)，PG-LH7(LH7)细胞系来自zhengjie教授的友好惠赠，SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)细胞系于上海细胞库获得，Anip973、AGZY83a细胞系购自上海拜利生物科技有限公司，这12种细胞系用含10％胎牛血清的RPMI1640(sigma，USA)或RPMIDMEM(sigma，USA)培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养。Rsf-1siRNA(h)与controlsiRNA购自Santa。转染前24小时将细胞按50％密度接种于6孔板，采用lipo2000转染试剂进行转染，转染后72小时Westernblot检测干扰效率。　　4、WesternBlot和细胞浆/核蛋白提取　　收集细胞加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000转/min，15min)，提取上清为总蛋白。按细胞浆/核提取试剂盒提取细胞浆和细胞核蛋白。考马斯亮蓝法蛋白定量，上样蛋白量为60ug。8％和10％SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜(Millipore，Bedford，MA，USA)，5％脱脂奶粉封闭，抗Rsf-1(1∶1000，Millipore，USA),MMP-2、MMP-7、MMP-9(1∶250,proteintech),NF-κB、Rho-A、Rho-B、Rho-C、E-cadharin(1∶100,SantaCruz),Snail(1∶250,CellSignaling,Boston,MA，USA)和β-actin、GAPDH(1∶1000，SantaCruz)4℃孵育过夜，分别与对应的二抗(1∶1000，SantaCruz)室温孵育2h，ECL(Pierce)显色，结果经BioImagingSystem(UVPInc,Upland,CA,USA)采集。　　5、细胞迁移和侵袭能力检测　　用含2％胎牛血清RPMI1640培养基重悬细胞，调至2.5×106个/ml细胞，取100ul加入上室中(孔径8um，Costar，USA)，下室加入600ul含10％胎牛血清RPMI1640培养基。37℃、5％CO2孵箱中培养24小时后吸尽培养基，PBS清洗后，预冷甲醇室温固定15min，用棉签轻擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下聚碳酸酯微孔膜，置载玻片上，镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清的RPMI1640培养基以1∶3稀释Matrigel(BDBiosciences，USA)加入上室20ul，37℃、5％CO2放置3小时。调至5×106个/ml细胞，取100ul加入上室中。使用前将培养基吸净，其他与迁移实验相同，培养30小时后观察结果。　　6、数据分析　　采用SPSS17.0统计分析软件，生存分析采用Kaplan-Meier法，用Log-rank检验判断差异性，其它实验结果采用t检验进行数据分析，P＜0.05为差异有意义。　　结果　　1、Rsf-1蛋白过表达与非小细胞肺癌患者预后相关　　我们采用免疫组化方法检测了Rsf-1蛋白在61例非小细胞肺癌及其癌旁正常肺组织中的表达情况。Rsf-1在正常支气管上皮及肺泡上皮均为阴性表达或弱着色。在61例非小细胞肺癌中Rsf-1低表达的为29例，低表达率为47.5％，高表达为31例，高表达率为52.5％。生存曲线显示Rsf-1高表达肺癌患者的生存期低于Rsf-1低表达者。　　2、在两种肺癌细胞系中转染Rsf-1特异性siRNA抑制肺癌细胞迁移侵袭　　Westernblot方法检测HBE及11种肺癌细胞系中Rsf-1的表达情况，发现在H1299和H460细胞中Rsf-1高表达。我们采用Rsf-1特异性siRNA干扰其在肺癌细胞系H1299和H460中的表达，通过westernblot检测转染效率。我们发现转染72小时后，与转染乱序siRNA的细胞相比，转染特异性干扰的细胞Rsf-1的表达明显下降。Transwell迁移实验证明下调Rsf-1蛋白表达，H1299及H460细胞的迁移能力受抑制。Transwell侵袭实验证明下调Rsf-1蛋白表达，H1299及H460细胞的侵袭能力受抑制。　　3、干扰Rsf-1下调肺癌细胞中MMP-2的表达　　为了研究干扰Rsf-1后肺癌细胞侵袭能力下调的机制，我们检测了黏附相关蛋白和运动侵袭相关蛋白的表达变化。我们发现，干扰Rsf-1后H1299和H460细胞中MMP-2蛋白含量下调。因此，Rsf-1干扰所致的迁移侵袭能力下调可能是由MMP-2下调所导致的。　　4、干扰Rsf-1可能通过NF-κB通路下调MMP-2的表达　　蛋白相互调控网络分析表明AKT、ERK和NF-κB信号通路活性可能受Rsf-1蛋白调控。有研究证实Rsf-1调控NF-κB的转录活性，因此在干扰Rsf-1后我们检测了NF-κB通路活性，发现核内的NF-κB减少。提示Rsf1可能激活NF-κB信号通路。进一步应用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082处理H460和H1299细胞后发现MMP-2的蛋白水平出现明显下调，与干扰Rsf-1后的趋势一致。提示Rsf-1可能通过NF-κB信号通路调节MMP-2的表达促进肺癌细胞迁移侵袭能力的　　讨论　　在卵巢癌、乳腺癌和头颈部癌中存在11q13.5的扩增。已报道，11q13.5包含几个候选的癌基因，包括Rsf-1，EMSY，PAK1，TAOS1，Rad9，CCND1，FGF3，和FGF4。在肺癌中也存在着11q13的扩增。已证实卵巢癌、鼻咽癌、胆囊癌和口腔鳞癌中Rsf-1基因扩增且与肿瘤细胞的恶性生物学行为及预后密切相关。在之前的研究中我们发现Rsf-1在肺癌中过表达，并且能促进肺癌细胞的增殖。然而，Rsf-1对细胞的迁移侵袭能力的影响及可能的机制未见报道。　　本研究证实了Rsf-1的过表达与非小细胞肺癌患者的不良预后相关。干扰Rsf-1在肺癌细胞中的表达明显抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭能力。提示Rsf-1能促进肺癌细胞的迁移和侵袭。　　大量的数据证明染色质重塑在肿瘤的发生中也有一定作用，然而他们在肿瘤进展中的确切机制还不清楚。有研究报道，在Rsf-1高表达的卵巢癌中Rsf-1激活ATM依赖的DNA损伤反应增加染色质的不稳定性。本研究发现干扰Rsf-1能够在一定程度上下调MMP-2表达。MMP-2对细胞外基质的降解和细胞的侵袭能力有重要作用[12-16]，因此Rsf-1可通过对MMP-2的调节来影响肺癌细胞的侵袭能力。　　在各种血液和实体恶性肿瘤中NF-κB信号通路失调。NF-κB信号通路的激活通过促进增殖，增强细胞存活，促进血管发生和转移参与致瘤过程。蛋白相互调控网络分析表明AKT、ERK和NF-κB信号通路活性可能受Rsf-1蛋白调控。在卵巢癌细胞中转染Rsf-1可明显增强依赖NF-κB的基因的表达和NF-κB的转录活性。因此在干扰Rsf-1后我们检测了NF-κB通路活性，发现核内的NF-κB减少。提示Rsf-1可能激活NF-κB信号通路。癌症相关的NF-κB依赖的基因包括编码细胞因子和趋化因子（如TNF-α，IL1，IL8，MCP-1），增值相关蛋白（如cyclinD1），抗凋亡蛋白（如Bcl-2，Bcl-XL，IAP），浸润和血管生成相关蛋白（如MMP，VEGF）。NF-κB依赖的MMP-2下调是S100A4抑制肾癌细胞迁移侵袭所必须。我们进一步应用NF-κB通路抑制剂BAY11-7082处理H460和H1299细胞后发现MMP-2的蛋白水平出现明显下调，与干扰Rsf-1后的趋势一致。提示Rsf-可能通过NF-κB信号通路调节MMP-2的表达影响肺癌细胞迁移侵袭能力的。　　综上所述，本研究证实了Rsf-1在非小细胞肺癌中呈过表达，并且其过表达与非小细胞肺癌患者的不良预后相关，下调Rsf-1表达能够抑制肺癌细胞的迁移侵袭能力。Rsf-1可能通过NF-κB信号通路调节MMP-2的表达，影响细胞迁移侵袭。因此，Rsf-1在肺癌发展中具有一定作用，可能成为治疗肺癌的候选靶点之一。　　结论　　1、Rsf-1在非小细胞肺癌组织中过表达，并且其过表达与非小细胞肺癌患者不良预后相关　　2、下调Rsf-1表达能够抑制肺癌细胞的迁移侵袭能力　　3、干扰Rsf-1能下调肺癌细胞中MMP-2的表达　　4、干扰Rsf-1可能通过NF-κB信号通路下调MMP-2的表达