论文部分内容阅读
第一部分ERK1/2与AECOPD患者中医证型相关性研究研究目的:通过观察细胞外信号调节激酶(ertracellular-signal regulated kinase,ERK)信号通路中主要标志性基因细胞外信号调节激酶1/2(ertracellular-signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)基因的mRNA在慢性阻塞性肺疾病的急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)患者不同中医证型中的表达,探讨ERK信号通路在AECOPD气道重建的作用,尝试从基因层面寻找AECOPD中医辨证分型量化标准。实验方法:收集AECOPD患者60人,根据中医辨证分型分为痰浊壅肺、痰热郁肺和痰瘀阻肺3个证型,每组20人,并与健康者20人进行对比。所有入选者清晨抽血,用试剂盒法提取血液总RNA,采用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-PCR)检测 ERK1/2、细胞增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene,HSG)在各组血液中mRNA的表达,探讨ERK1/2、HSG基因在AECOPD患者痰浊壅肺、痰热郁肺及痰阻肺不同中医证型差异性表达的意义。统计方法:采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,以均数±标准差(x±s)表示计量资料,若总体服从正态分布,用One-Way ANOVA检验,若样本不服从正态分布,采用非参数检验。实验结果:1、AECOPD患者血清中HSG基因表达情况如下:痰浊壅肺组为0.542±0.031,痰热郁肺组为0.537±0.030,痰瘀阻肺组为0.518± 0.024,正常对照组血清HSG基因相对表达量为0.588±0.069,AECOPD患者血清HSG基因相对表达量较正常对照组降低,P<0.05,差异有统计学意义。2、AECOPD患者血清中ERK1/2基因表达情况如下:痰浊壅肺组为2.013 ±0.377,痰热郁肺组为2.164±0.350,痰瘀阻肺组为2.330± 0.298,正常对照组血清ERK1/2基因相对表达量为1.108±0.355,AECOPD患者血清ERK1/2基因相对表达量较正常对照组明显升高,P<0.05,差异有统计学意义。实验结论:ERK1/2基因mRNA的相对表达量从痰浊壅肺→痰热郁肺→痰瘀阻肺逐渐增加,HSG基因则与之相反,为寻找AECOPD中医辨证分型量化及诊断依据提供了一定经验。第二部分HSG调控ERK信号通路抑制COPD大鼠气道重建的研究研究目的:探讨细胞增殖抑制基因调控COPD气道重建的机制,为基因靶向治疗打下基石。实验方法:将所购SD大鼠采用随机数字表法分为正常对照组10只,COPD模型组40只,参考宋一平烟熏+脂多糖注射复合法构建模型。免疫印迹法(Western blotting,WB)检测各组大鼠气道成纤维细胞中HSG、ERK1/2蛋白表达量;RT-PCR法检测各组大鼠气道成纤维细胞中HSG、ERK1/2基因的mRNA相对表达量;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor,PDGF)、转化生长因子β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)、基质金属蛋内酶 9(matrix metalloprotein 9,MMP-9)在各组大鼠小气道组织上清液的蛋自表达量。统计方法:采用SPSS16.0统计软件进行数据分析,用均数±标准差(x±s)表示计量资料,若总体服从正态分布,用成组t检验,反之则用非参数检验。用线性回归spearman积差相关系数进行相关性分析。实验结果:1.COPD大鼠气道成纤维细胞中ERK1/2蛋白表达为0.591 ±0.099,正常组大鼠气道成纤维细胞中ERK1/2蛋白表达为0.269±0.061,P<0.05,COPD大鼠气道成纤维细胞中ERK1/2蛋白表达较正常大鼠增高。正常组大鼠气道成纤维细胞中HSG蛋白表达为0.649±0.080,COPD组大鼠气道成纤维细胞中HSG蛋白表达为0.287±0.112,COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG蛋白表达较正常大鼠减低,P<0.01,有显著统计学意义;2.COPD大鼠小气道组织上清液中PDGF蛋白表达量为26.49±0.44,TGF-β 1蛋白表达量为82.50± 1.23.MMP-9蛋白表达量为12.04±0.75,COPD大鼠小气道组织上清液中三者蛋白表达量较正常组表达均增高,P<0.01,有显著统计学意义;3.COPD大鼠气道成纤维细胞中PDGF基因表达量为2.046±0.151,TGF-β 1基因表达量为1.970±0.018.MMP-9基因表达量为1.758±0.389,ERK1/2基因表达量为2.036±0.174,COPD大鼠气道成纤维细胞中以上四者基因表达量较正常组表达均增高,P<0.05,差异有统计学意义;4.COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG基因mRNA相对表达量与MMP-9 mRNA相对表达量呈直线负相关关系,且相关系数为r=-0.485,P<0.05;COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG基因mRNA相对表达量与PDGF mRNA相对表达量呈直线负相关关系,且相关系数r=-0.519,P<0.05;COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG基因mRNA相对表达量与TGF-β1 mRNA相对表达量呈直线负相关关系,且相关系数r=-0.519,P<0.05;COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG基因mRNA相对表达量与ERK1/2 mRNA相对表达量呈直线负相关关系,且相关系数r=-0.617,P<0.05。实验结论:COPD大鼠气道成纤维细胞中ERK1/2的表达较正常组大鼠增高,而HSG表达较正常组大鼠减低。在COPD大鼠气道成纤维细胞中HSG基因与MMP-9、PDGF、TGF-β1、ERK1/2的mRNA相对表达量之间存在直线负相关关系,HSG可调控ERK1/2的磷酸化,从而遏制MMP9、TGF-β1、PDGF的过表达,干预COPD大鼠气道重建。