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[研究目的]目前已有使用小鼠等动物模型进行心肌肥大研究的报道,此类模型与人类差异较大,研究人类心血管疾病最理想的是人类的心肌细胞,其极难获取,且缺乏分裂增殖能力而不能在实验室长期存活,因此使用更接近于人类心肌细胞的人多能干细胞衍生的心肌细胞建立人源性心肌肥大模型具有更大的研究和参考价值。本研究主要通过H9人胚胎干细胞(H9 human embryonic stem cells,H9 hESCs)衍生的心肌细胞(H9-derivedcardiomyocytes,H9-CMs)建立稳定的“人源性”心肌肥大模型,并将TRPC1敲除的H9多能干细胞株定向分化为心肌细胞,通过对野生型(Wildtype,WT)和TRPC1敲除(Knockout,KO)的心肌细胞进行功能学分析和转录组测序,阐明TRPC1调控人类心肌肥大发生的分子机制。[研究方法]本研究依据设立不同浓度梯度的佛波醇-12-肉豆寇酸酯-13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)对 H9-CMs 进行诱导实验,通过实时荧光定量PCR检测心肌肥大Marker心房利钠因子(Atrial natriuretic factor,ANF)的表达确定了 PMA最佳诱导浓度和时间,建立稳定的PMA诱导H9-CMs的心肌肥大模型;通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术建立TRPC1敲除的H9细胞系并成功分化为心肌细胞;针对WT和KO组H9-CMs心肌细胞进行形态学分析、电生理分析和钙信号分析等相关功能研究,并以RNA-seq转录组测序结果为依据进行信号通路分析,阐明TRPC1调控心肌肥大发生的分子机制。[研究结果]通过CRISPR/Cas9技术对H9细胞进行TRPC1敲除,并通过测序鉴定获得敲除成功的H9细胞株。应用基于小分子化合物的方法学将WT和KOH9细胞成功分化成心肌细胞。以PMA诱导H9-CMs建立稳定的“人源性”心肌肥大模型(最佳诱导方案:1μMPMA作用4天),诱导后的心肌细胞具有明显的心肌肥大表型,包括:细胞增大、多核细胞比例增多、ANF表达上调;而KO组心肌细胞经PMA诱导后表现为显著减弱的心肌肥大反应,细胞大小、多核细胞比例和ANF表达相比诱导前无显著变化。免疫染色、Western blot和荧光素酶assay等实验显示WT组心肌细胞经PMA诱导后NF-κB信号通路激活,表现为磷酸化IκBαα蛋白表达显著增加、P65转位增加以及NF-1κB活性增强;而KO组心肌细胞经PMA诱导后表现为显著减弱的NF-κB信号通路激活。正常心肌细胞中过表达TRPC1基因可引起心肌肥大表型,而NF-κB信号通路抑制剂IKK16可有效抑制该表型。[结论]我们成功建立PMA诱导的稳定的“人源性”心肌肥大模型,并成功建立了TRPC1敲除的多能干细胞株,TRPC1表达上调与心肌肥大存在正相关性,心肌细胞中过表达TRPC1基因引起心肌肥大反应,TRPC1通过激活下游NF-κB信号通路引起心肌肥大的发生。