不同程度低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达对髓核细胞凋亡的影响

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目的细胞凋亡在椎间盘退变中的意义越来越得到大家的关注,对于细胞凋亡机制的研究也越来越受到重视。低氧诱导因子-1α是20世纪90年代对氧感受器-信号传导-效应基因的低氧反应通路的重要发现。多数学者认为HIF-1α是诱导低氧基因和维持细胞氧内环境稳定的核心因子,可以调节能量代谢,血管形成,细胞凋亡,细胞分化,基质合成等相关基因的表达。Kee-Yong Ha等人研究发现在不同程度人突出椎间盘中,HIF-1α的表达程度与细胞凋亡程度之间存在高度相关性,而凋亡程度的增加是否与HIF-1α的高表达有关有待于进一步研究。本实验立足于此点,探讨培养的髓核细胞中低氧诱导因子(HIF-1α)表达程度的不同与细胞凋亡之间的关系,进而探讨低氧诱导因子与间盘退变的关系。方法取30日龄SD大鼠髓核进行原代培养,通过控制培养箱氧浓度诱导低氧诱导因子不同程度表达,将传代得到的细胞分为4组施加处理因素:A组:正常氧条件组:O2 21%,CO2 5%,N2 74%;B组:低氧条件组:O2 5%,CO2 5%,N2 90%(模拟正常间盘环境);C组:低氧条件并经COCl2诱导组:O2 2%,CO2 5%,N2 93%(HIF-1α高表达组);D组:低氧条件并经Genistein(酪氨酸蛋白激酶抑制剂)处理组:O25%,CO2 5%,N2 90%(HIF-1α表达受抑制)。各组在各自条件下培养24小时,运用westem-blot检测各组低氧诱导因子表达量,通过流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡情况。运用SPSS11.5软件对实验结果进行相关分析。结果通过细胞原代培养及纯化后得到实验所需的髓核细胞,在倒置显微镜下观察可见细胞呈多角形或梭形,轮廓清楚,细胞核呈圆形。通过SABC法检测髓核细胞中表达的Ⅱ型胶原,镜下观察可见细胞浆中Ⅱ型胶原被染成棕色,核圆蓝染。通过Western-blot检测到各个组中均有HIF-1α的表达,B组和C组HIF-1α表达明显多于A组和D组,其中C组表达最多。各组间具有显著性差异(P<0.01)。流式细胞术结果可见各组细胞G。前出现凋亡细胞峰,C组凋亡率明显高于各组,D组低于B组和C组。各组之间具有明显差异(P<0.01)。C组的HIF-1α表达和凋亡率明显高于A组和B组,而D组则低于B组和C组。相关分析提示Pearson相关系数为0.668,P<0.001,相关具有统计学意义。通过本实验可以得到氧浓度越低,低氧诱导因子表达的量越多,HIF-1α表达越高细胞凋亡率越高,而加抑制剂组细胞凋亡率较HIF-1α高表达组低。结论HIF-1α高表达可以诱导髓核细胞凋亡程度的增加,从而证明了HIF-1α是髓核细胞凋亡的一个诱发因素,并证实过度的低氧刺激是间盘退变突出的一个重要诱因。
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