【摘 要】
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清道夫受体（Scavenger receptors,SRs）是一类典型的内吞型模式识别受体,位于巨噬细胞膜表面,可以识别并结合多种配体,包括各种修饰或氧化的低密度脂蛋白、凋亡细胞和病原体。其中B型清道夫受体（SR-B）具有广泛的配体,可以结合不同脂蛋白及多聚阴离子磷脂类等物质,参与有机体一系列的生理或病理过程,在动脉粥样硬化和心血管疾病的形成或抑制、凋亡细胞的清除、宿主机体免疫防御等生命过程中起着
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清道夫受体（Scavenger receptors,SRs）是一类典型的内吞型模式识别受体,位于巨噬细胞膜表面,可以识别并结合多种配体,包括各种修饰或氧化的低密度脂蛋白、凋亡细胞和病原体。其中B型清道夫受体（SR-B）具有广泛的配体,可以结合不同脂蛋白及多聚阴离子磷脂类等物质,参与有机体一系列的生理或病理过程,在动脉粥样硬化和心血管疾病的形成或抑制、凋亡细胞的清除、宿主机体免疫防御等生命过程中起着极其重要的作用。刺参作为重要的经济养殖品种,其产业发展受到细菌、病毒引起的病害问题的严重制约,而清道夫受体位于生物体内面对入侵病原体的第一道防线,深入研究SR-B在刺参免疫反应中的作用及其免疫调节途径显得尤为重要和急迫。本研究通过基因克隆的方法获得刺参B型清道夫受体（Aj SR-B）全长,进行系统进化分析;研究灿烂弧菌胁迫刺参个体后其体内Aj SR-B的表达特异性以及体腔细胞中Aj SR-B蛋白亚细胞定位;体外重组表达Aj SR-B并检测其对PAMPs和各类病原菌的识别结合能力;体内干扰Aj SR-B基因,明确Aj SR-B在刺参抵御病原体入侵中的作用。主要研究结果如下:（1）通过RACE技术克隆获得Aj SR-B基因全长2519 bp,包括1581 bp的开放阅读框,编码526个氨基酸。SMART分析表明,Aj SR-B包含一个保守的CD36结构域、两个跨膜结构域以及分别位于N末端和C末端的两个胞内区。其中,有九个潜在的N-糖基化位点位于胞外区的CD36结构域中。BLAST和进化树分析表明,Aj SR-B与光棘球海胆（Mesocentrotus nudus）和紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus）序列较为相似,亲缘关系较近。（2）组织分布表明,Aj SR-B m RNA广泛分布于刺参各个组织中,其中,在肠组织中的表达水平最高,为对照组（体腔细胞）的181.6倍（P＜0.01）,其次是触手和呼吸树,分别为对照组的21.3倍（P＜0.01）和12.9倍（P＜0.01）。此外,在灿烂弧菌胁迫刺参24 h后,Aj SR-B的m RNA在体腔细胞和肠组织中的表达均显著上升且达到最高值,分别为对照组的2.42倍（P＜0.01）和1.70倍（P＜0.01）,随后,体腔细胞中的Aj SR-B m RNA表达水平在48 h下调至正常水平,而在肠组织中一直维持较高水平。（3）根据序列分析,扩增得到Aj SR-B基因胞外结构域序列,构建Aj SR-B-p ET-28a（+）-Rosetta（DE3）重组表达菌株,IPTG诱导表达并纯化。获得了His-Aj SR-B融合蛋白,分子量大小约为52 k Da,制备多克隆抗体。亚细胞定位分析揭示Aj SR-B蛋白定位于体腔细胞的细胞膜表面。（4）复性后的His-Aj SR-B融合蛋白对脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、甘露聚糖（MAN）均有较强的结合活性,其中对LPS的最大结合参数是2.6026,PGN的最大结合参数是2.6366,两者均高于MAN的最大结合参数2.056。表观解离常数表明,重组Aj SR-B蛋白对不同的PAMP具有不同的亲和力。（5）复性后的His-Aj SR-B融合蛋白在含有钙离子的环境中对灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌及藤黄微球菌都有明显的凝集作用,在不含钙离子的环境中对上述四种菌均表现为无凝集作用。在凝集实验中引入游离的LPS,PGN和MAN,His-Aj SR-B融合蛋白对灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌失去凝集效果,对藤黄微球菌仍有较低水平的凝集效果,表面Aj SR-B蛋白凝集活性取决于钙离子依赖的模式识别受体的结合能力。（6）在刺参个体内干扰Aj SR-B基因后,体腔细胞的吞噬能力受到极大的抑制,下降到对照组的31%,同时与吞噬相关的网格蛋白和小凹蛋白的表达也受到显著抑制,表明Aj SR-B在调控刺参体腔细胞的吞噬过程中可能与网格蛋白和小凹蛋白的表达有关。本论文研究结果表明,Aj SR-B是一种典型的B型清道夫受体,定位于细胞膜表面,可以识别LPS、PGN和MAN等,对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有凝集作用,在刺参体腔细胞的吞噬作用起重要作用,参与了刺参多种免疫反应。研究结果为今后深层次认识刺参清道夫受体的免疫功能提供基础。
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