目的胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,由于其分子机制的复杂性和临床病人的异质性,胃癌的死亡率位列世界第三,且发病率呈现逐年上升的趋势。虽然目前针对胃癌的治疗手段很多,包括手术切除、放疗和化疗等,但是胃癌患者的五年生存率仍然很低,并且胃癌的预后比较差,因此了解胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的治疗和预后具有重要的临床意义。目前已有研究结果普遍认为,Wnt信号通路在生物体胚胎形成和发育过程中扮演了重要角色,同时Wnt信号通路可以调控干细胞的更新和分化。但是近年来越来越多研究表明,Wnt信号通路的异常也与肿瘤,包括肝癌、非小细胞肺癌、结肠癌等疾病也存在着显著相关。因此,Wnt信号通路的研究对探索疾病治疗的新方法有重要价值。Wnt信号通路有多种激动剂,其中R-spondin在性别决定、胚胎四肢形成及血管形成等方面起关键作用。作为R-spondin的受体,富亮氨酸G蛋白偶联受体(leucine-rich repeat-containg G protein-coupled receptor,LGR)通过与 Lrp、Wnt 以及Frizzled形成复合物,形成的复合物可以进一步激活Wnt通路,从而促进肿瘤的发生发展等生物学进程。本研究旨在探索Wnt信号通路激动剂之一的R-spondin受体LGR6与胃癌的关系,并通过体外实验探究LGR6是否参与调控胃癌的增殖、侵袭等生物学过程,探索LGR6参与的信号通路及其在胃癌的病理生理过程中的作用,从而为胃癌的诊断、预后判断及寻找新的药物治疗靶点等提供一定的理论依据。方法第一部分1.收集不同病理分期的胃癌组织样本,通过免疫组化技术检测LGR6的表达,同时随访统计LGR6表达高低与胃癌分期、复发转移及胃癌患者五年生存的相关性。2.收集20例配对的新鲜的胃癌组织及癌旁正常组织,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测LGR6的基因和蛋白表达的差异。第二部分1.培养正常胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞株MGC-803和MKN-45,通过qRT-PCR及Western blot法检测三株细胞中LGR6基因和蛋白的表达水平差异。2.根据NCBI提供的人的LGR6基因信息,利用在线设计软件设计合成多对LGR6的siRNA干扰序列及无意义的对照干扰片段,同时构建LGR6的过表达载体。将测序正确的LGR6过表达质粒进行转化并细菌涂板,挑选单克隆进行摇菌扩培,参照质粒抽提试剂说明书提取质粒。随后培养胃癌细胞株MGC-803和MKN-45细胞,采用LipofectamineTM 2000法对细胞进行转染,采用qRT-PCR法和Western-blot方法检测转染后细胞中LGR6的表达变化。3.体外胃癌细胞株MGC-803和MKN-45中,进行细胞瞬时转染。实验分组设置为:对照组(si-Ctrl),LGR6干扰组(si-LGR6)及LGR6干扰48hr后再转染LGR6过表达质粒(Rescue),采用MTT实验检测细胞的体外增殖能力改变,Annexin-V/PI流式双染色法检测细胞凋亡率的改变。同时应用Materigel-transwell法检测细胞体外侵袭能力的改变,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的改变。4.在胃癌细胞MGC-803和MKN-45中,LGR6干扰或者干扰后进行LGR6过表达质粒回补,采用qRT-PCR及Western-blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax和Caspase-3)的基因和蛋白表达的变化,同时采用Western blot法检测磷酸化的AKT/mTOR蛋白及总AKT/mTOR蛋白的表达变化,进一步明确LGR6参与调控胃癌发生发展的可能的分子机制。结果1.对胃癌组织及癌旁正常组织进行检测,结果提示,与胃癌癌旁正常组织比较,胃癌组织中LGR6的表达比癌旁正常组织中LGR6的表达显著增加。2.通过对LGR6的表达与胃癌患者的临床病理特征进行统计分析,结果提示,LGR6的表达水平差异与胃癌的病理分期、淋巴结转移及患者的五年生存时间显著相关。LGR6高表达的胃癌患者五年生存时间低于LGR6低表达的胃癌患者。3.与正常的胃上皮细胞GES-1细胞比较,胃癌细胞株中MGC-803和MKN-45的LGR6的基因和蛋白表达均显著增加。4.在胃癌细胞株MGC-803和MKN-45中分别转染LGR6干扰质粒(si-LGR6),转染LGR6干扰质粒48hr后再转染LGR6过表达质粒,同时设置对照组(si-Ctrl)。qRT-PCR和Western blot实验结果提示,与对照组比较,LGR6干扰组的LGR6表达显著降低,且第3对LGR6的siRNA干扰片段干扰效果最好,干扰效率达到80%以上。5.在胃癌细胞MGC-803和MKN-45中干扰LGR6,可降低细胞增殖速率并促进细胞凋亡。同时LGR6干扰后与对照组比较,细胞侵袭细胞数及迁移细胞数降低。转染LGR6干扰质粒48 hr后转染LGR6过表达质粒,结果提示与LGR6干扰组比较,细胞增殖率增加凋亡细胞数减少,同时迁移及侵袭细胞数均增加。6.在胃癌细胞MGC-803和MKN-45中转染LGR6干扰质粒,结果提示与对照组比较,细胞凋亡相关基因Bcl-2表达降低,但Bax和Caspase-3的表达增加,高于si-Ctrl对照组。Western-blot结果提示,LGR6干扰后,磷酸化的AKT和mTOR的表达水平均降低,但总的AKT和mTOR的蛋白水平不变。当LGR6敲低后再在细胞中转染LGR6过表达质粒进行LGR6回补,细胞凋亡相关基因Bcl-2的表达增加,但Bax和Caspase3表达降低,回到与si-Ctrl组近似的表达水平。进一步研究发现,LGR6回补后,磷酸化的AKT和mTOR的水平比LGR6干扰组增加,回到正常水平。结论1.LGR6高表达与胃癌恶性程度、淋巴结转移相关,同时LGR6高表达胃癌患者五年生存率低于LGR6低表达患者。2.LGR6敲低后可抑制胃癌细胞MGC-803和MKN-45的增殖、侵袭和迁移,同时可以促进胃癌细胞的凋亡。3.LGR6干扰后降低磷酸化的AKT/mTOR蛋白水平,总磷酸化的AKT和mTOR的表达水平不发生改变。4.LGR6有可能成为胃癌诊断及不良预后的新分子标志物,同时为胃癌的治疗提供了新的分子靶点。