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脂肪细胞可以蓄积甘油三酯(TG)以备能量的消耗。与哺乳动物相似,鱼类脂肪细胞内过度蓄脂也会引发一系列代谢疾病。内质网是营养素的敏感感受器,参与细胞内脂质的合成与转运。细胞内外因素刺激会造成内质网应激(ERS),随后诱发未折叠蛋白反应(UPR)以缓解内质网应激,且经典UPR通路及独立于UPR通路的糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)均对哺乳动物脂肪组织和肝脏的脂质代谢具有调控作用。但是,ERS对草鱼脂肪细胞脂质蓄积的作用尚不明确。本研究采用草鱼原代脂肪细胞培养、基因克隆等细胞及分子生物学技术,综合分析ERS对草鱼脂肪细胞脂质蓄积的影响及作用机制。获得的主要研究结果如下:1.油酸(OA)处理草鱼脂肪细胞后脂质代谢状况研究为构建脂肪细胞脂质蓄积模型,离体条件下,通过酶消化法获得草鱼前体脂肪细胞,待前体脂肪细胞生长汇合(大约7天),向培养基中加入400μM OA,48小时后收样。采用CCK-8法测定细胞活力,尼罗红染色和DAPI染色观察脂肪细胞内的脂质蓄积情况,酶法进行甘油三酯的定量检测,试剂盒检测培养基中甘油释放量,RT-PCR检测脂质代谢相关基因m RNA表达水平。结果发现:(1)400μM OA处理显著提高细胞活力(P<0.01),且胞内脂滴数量明显增多、体积变大,脂肪细胞内的甘油三酯含量显著增加(P<0.01);(2)脂质水解相关基因ATGL、HSLa、HSLb和脂肪酸(FA)β氧化相关基因PPARα、CPT1α的m RNA表达水平均显著上调(P<0.05),培养基中的甘油含量亦显著增加(P<0.01);(3)脂肪细胞分化相关基因PPARγ和脂质合成相关基因SREBP1c、FAS、ACCα、DGAT2的m RNA表达水平均显著上调(P<0.05)。研究表明,草鱼脂肪细胞脂质分解和脂质合成过程均可被OA促进,可能由于脂质合成的作用大于脂质分解的作用,最终导致脂肪细胞脂质蓄积水平升高。2.内质网应激经典UPR通路介导草鱼脂肪细胞的脂质蓄积为探究内质网应激对草鱼脂肪细胞脂质蓄积的影响,离体分离草鱼脂肪组织得到前体脂肪细胞,生长汇合后,采用不同浓度内质网应激抑制剂4-苯基丁酸钠(4-PBA)(0、5、10、15、20μM)预孵育4小时,然后分别与400μM OA共孵育脂肪细胞48小时,收集细胞样品。采用尼罗红染色和DAPI染色观察脂肪细胞内的脂质蓄积情况,试剂盒酶法进行甘油三酯的定量检测,RT-PCR检测内质网应激和脂代谢相关基因m RNA表达水平。结果发现:(1)400μM OA处理显著上调了经典UPR通路相关基因GRP78、ATF6、PERK、e IF2α、CHOP的m RNA表达水平(P<0.05),表明在脂肪细胞脂质蓄积过程中内质网应激被激活;(2)10μM 4-PBA处理显著下调了内质网应激相关基因GRP78、PERK、e IF2α、CHOP、IRE1α、ATF6的m RNA表达水平(P<0.05)和GRP78的蛋白表达水平,表明内质网应激被缓解;(3)10μM 4-PBA处理使脂肪细胞脂滴数量明显减少,甘油三酯含量显著降低(P<0.05);(4)脂肪细胞分化相关基因PPARγ、C/EBPα和脂质合成相关基因FAS、ACCα、SCD1、DGAT1a、DGAT1b、DGAT2的m RNA表达水平均显著下调(P<0.05)。研究表明,在OA诱导草鱼脂肪细胞脂质蓄积过程中,内质网应激被激活,且经典UPR通路参与了脂肪细胞中的脂质蓄积。3.草鱼GSK-3β基因克隆、生物信息学分析及在脂肪细胞脂质蓄积中的作用哺乳动物上的研究发现,ERS不仅可以激活UPR参与脂质代谢,也可以通过激活GSK-3β调节脂质蓄积。为探究GSK-3β在草鱼脂肪细胞脂质蓄积过程中的作用,首先克隆获得草鱼GSK-3β1、GSK-3β2完整CDS序列,鉴定其分别编码421、457个氨基酸;对其进行生物信息学分析;RT-PCR检测GSK-3β1、GSK-3β2的组织表达谱及在脂肪细胞脂质蓄积过程中其m RNA的表达情况。结果发现:(1)与人、鼠、猪、鸡及斑马鱼、鲤鱼相比,草鱼GSK-3β序列和功能结构域保守;GSK-3β1基因结构高度保守,GSK-3β2基因结构相对保守,丢失外显子8和11;(2)草鱼GSK-3β1、GSK-3β2是由于硬骨鱼类基因组加倍事件产生;(3)草鱼GSK-3β1在脂肪组织中高表达,GSK-3β2在肝脏中高表达;(4)在脂肪细胞脂质蓄积过程中,GSK-3β1、GSK-3β2、β-catenin m RNA表达水平均显著上调(P<0.05)。研究表明,GSK-3β可能通过GSK-3β/β-catenin通路参与了草鱼脂肪细胞脂质蓄积。综上所述,草鱼脂肪细胞脂质蓄积过程中,内质网应激被激活,其引发的经典UPR通路参与了脂肪细胞的脂质蓄积过程,而独立于经典UPR通路的GSK-3β信号分子可能参与了脂质蓄积过程。