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缺血性心脏病是威胁人类健康和生命以及影响生存质量的重要疾病,针对缺血性心脏病,恢复冠脉血流的灌注再通就尤为重要。近年来,随着冠状动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术等方法的广泛使用,使临床上出现越来越多的心肌缺血再灌注损伤的患者。心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury MIRI)是指心肌在缺血损伤基础上再灌注,反而进一步引起其功能、代谢及电生理方面的损伤。目前研究表明氧自由基、钙超载、心肌能量代谢障碍、中性粒细胞、血管内皮细胞、血红素加氧酶-1、低氧诱导因子-lα等均可能参与MIRI的发生和发展,其中最重要的是氧自由基机制。随着对自由基研究的日渐深入,清除自由基,减少自由基对恢复灌流再通后的危害的方法也逐渐被揭示出来。体内时刻都存在自由基生成过程,但机体内源性抗氧化系统可随时将自由基清除,使机体氧化-抗氧化过程处于一种动态平衡状态。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)是一种特异性内源性自由基清除剂。因此增加细胞内Cu/Zn-SOD水平有望成为防治缺血再灌注损伤的有力措施之一,但由于SOD在细胞膜上没有专一受体或通道,外源性SOD难以进入细胞和组织内发挥生物学作用,因而限制了其临床应用。蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain, PTD)是一种能携带大分子物质无特异性的穿透哺乳动物细胞膜的小分子阳离子多肽。研究发现可以通过优化PTD结构域的空间结构和表面的电子分布来提高PTD结构的内化效率,达到携带大分子物质高效进入细胞内发挥生物学效应的目的。本课题组选择SOD与PTD重组,利用PTD的穿膜功能将原本不能穿过细胞膜的SOD转导至细胞内发挥生物学作用,有望解决临床上外源性抗氧化物体内抗氧化效率低的问题,为减轻心肌缺血再灌注损伤提供新的方法和思路。第一部分重组PTD-Cu/Zn SOD的制备目的设计、构建、表达、纯化PTD-Cu/Zn SOD蛋白原核表达质粒。方法设计跨膜活性的PTD多肽跨膜结构域,扩增人Cu/Zn SOD全长CDs引物,选择PET16b原核表达载体和pGEM(?)-T克隆载体。提取胚胎肝脏组织的总RNA,以其为模板用于Cu/Zn SOD全长CDs的逆向转录和扩增,将获得的Cu/Zn SOD全长CDs片段,加腺嘌呤处理纯化后插入pGEM-T载体,获得pGEM-Cu/Zn SOD(CDs)载体,用测序引物测序与GENEBANK CDs比对,鉴定插入片段的正确性。用XhoI、BamHI酶切获得的pGEM-Cu/Zn SOD (CDs)载体,获得两端带有粘性末端的双链全长Cu/Zn SOD CDs片段,同时用同样的酶对pET-16b空载体进行双酶切。胶回收两端带有粘性末端的线性载体及Cu/Zn SOD全长CDs片段,将其定向插入pET-16b空载体,获得pET-Cu/Zn SOD (CDs)原核表达载体。对上述获得的pET-Cu/Zn SOD (CDs)原核表达载体进行特异性酶切,并根据PTD设计的两条简并寡核苷酸序列进行高特异性退火杂交,获得人工合成的两端带有限制性内切酶粘性末端的小片段简并双链DNA序列,将其插入上述线性载体中,获得pET-PTD-Cu/Zn SOD (CDs)原核表达载体,并同pET-Cu/Zn SOD导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni2+亲和层析、收集目的蛋白。结果通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致。设计并简并PTD-Cu/Zn SOD基因长度为567bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GENBANK中Cu/Zn SOD序列相一致。并构建了相应的原核表达质粒。并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD-Cu/Zn SOD具有良好水溶性。SDS-page分析显示构建的PTD-Cu/Zn SOD分子量约为20kDa,与预期的蛋白分子量20.45kDa相符合。结论成功设计并构建了新型蛋白转导结构域PTD,并与Cu/Zn SOD重组后表达、纯化了水溶性的融合蛋白。为PTD后续的功能和应用研究打下基础。第二部分PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用研究目的观察PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白穿膜能力,探讨其对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用。方法使用邻苯三酚法检测PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白的抗氧化酶活性,分别加入10umol/L等量的SOD、Cu/Zn SOD和PTD-Cu/Zn SOD作为反应底物时,测得氧化速率。人心肌细胞株购于ATCC。在细胞的培养液中不加任何处理因素(Normal组),或分别加入10μmol/L的SOD (SOD组)、10μmol/L的Cu/Zn SOD (Cu/Zn SOD组)、10μmol/L的PTD-Cu/Zn SOD (PTD-Cu/Zn SOD组),孵育10min,免疫荧光法和western blot法检测融合蛋白穿膜能力,PCR法检测细胞内SOD的mRNA水平。用厌氧培养箱培养(85%N2,10%H2,5%CO2)制作缺氧复氧损伤模型,然后在缺氧复氧损伤的细胞培养液中不加任何处理因素(HRI组),或分别加入10μmol/L的SOD(HRI+SOD组)、10μmol/LCu/Zn SOD (HRI+Cu/Zn SOD组)、10μmol/L PTD-Cu/Zn SOD (HRI+PTD-Cu/Zn SOD组),且以正常人心肌细胞作为正常对照组(Normal组),孵育10min后,超氧化物阴离子荧光探针法检测心肌细胞内超氧化物阴离子水平,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,Hoechst33342和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)双染法检测细胞凋亡和坏死。结果1.邻苯三酚白氧化法检测蛋白活性,分别加入10umol/L等量的SOD、 Cu/Zn SOD和PTD-Cu/Zn SOD作为反应底物时,测得氧化速率分别为0.17±0.03OD/min,0.16±0.04OD/min,0.19±0.05OD/min,均明显低于邻苯三酚的自氧化速率；2.免疫荧光染色结果显示经PTD-Cu/Zn SOD处理的细胞内荧光比SOD和Cu/Zn SOD处理的细胞内荧光强；3. Western blot法检测心肌细胞内SOD或His的水平显示PTD-Cu/Zn SOD处理组细胞内SOD和His水平明显高于正常组及SOD组、Cu/Zn SOD处理细胞；4.PCR法检测细胞内SOD的mRNA水平结果显示,用SOD、Cu/Zn SOD、PTD-Cu/Zn SOD处理心肌细胞后,细胞内SOD的mRNA水平没有差异；5.超氧化物阴离子水平的评价：PTD-Cu/Zn SOD处理细胞后,细胞内红色荧光显著减弱,阳性细胞数量明显减少,其处理后细胞内超氧化物阴离子水平明显下降。6.线粒体膜电位结果表明缺氧复氧损伤后大部分细胞出现绿色的荧光,线粒体膜电位下降明显,SOD和Cu/Zn SOD不能逆转线粒体膜电位的下降,HRI+PTD-Cu/Zn SOD则明显减轻线粒体膜电位下降。7. PTD-Cu/Zn SOD明显减轻缺氧复氧损伤后细胞凋亡和坏死的发生。结论PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白能够高效的穿透心肌细胞膜,并保持其活性。PTD-Cu/Zn SOD能有效清除心肌细胞内活性氧,减轻活性氧对缺氧复氧心肌细胞的损伤,最终减少缺氧复氧损伤引起的心肌细胞的凋亡和坏死。第三部分PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白对心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究目的探讨PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白对在体动物心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法选择雄性SD大鼠,通过结扎与松解左冠状动脉前降支的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。制备心脏冰冻切片,TTC染色后,观察心肌梗死面积。冠状动脉结扎开放后,通过左心房注射SOD、Cu/Zn SOD和PTD-Cu/Zn SOD,免疫荧光法和western blot法检测融合蛋白穿膜能力,PCR法检测细胞内SOD的mRNA水平。冠状动脉开放120min后,抽取大鼠血液,比色法检测大鼠CK, CK-MB, LDH的含量,TBA染色法检测MDA的含量。通过对心肌组织切片的凋亡和坏死染色,检测心肌组织中细胞凋亡和坏死情况。结果1.通过对心肌进行TTC染色,PTD-Cu/Zn SOD明显减少心肌梗死面积,而SOD和Cu/Zn SOD处理的心肌组织梗死面积没有明显改变。2.通过对SOD进行免疫荧光染色,结果提示PTD-Cu/Zn SOD处理的心肌细胞中有明显的荧光,而其他蛋白处理的细胞内荧光很弱。而针对构建蛋白中的His结构的免疫荧光结果也提示PTD-Cu/Zn SOD处理的心肌细胞中有明显的荧光。3.梗塞区心肌组织内的SOD进行定量分析,PTD-Cu/Zn SOD处理的心肌组织中SOD含量最高。4.梗塞区心肌组织内的SOD的mRNA水平进行了检测,所有动物梗塞区心肌组织内SOD的mRNA均与正常心肌内SOD的mRNA水平相当。5.比色法检测血清CK、CK-MB、LDH、肌钙蛋白值发现,与S组比较,I/R组、Cu/Zn SOD组、PTD-Cu/Zn SOD组CK、CK-MB、LDH、肌钙蛋白值均明显升高,I/R组与Cu/Zn SOD组无明显差异,PTD-Cu/Zn SOD组较I/R组和Cu/Zn SOD组明显降低；6.TBA法检测血清MDA值发现,与S组比较,I/R组、Cu/Zn SOD组、PTD-Cu/Zn SOD组MDA值均明显升高,I/R组与Cu/Zn SOD组无明显差异,PTD-Cu/Zn SOD组较I/R组和Cu/Zn SOD组明显降低。7.通过对心肌组织切片的凋亡和坏死染色,定量分析结果提示缺血再灌注后梗塞区心肌细胞的凋亡与坏死明显增多,PTD-Cu/Zn SOD处理后,明显降低心肌细胞的凋亡与坏死。结论PTD-CuZnSOD融合蛋白能够作用于缺血再灌注损伤大鼠心肌,通过有效的清除氧自由基,减少氧自由基的脂质过氧化反应,减少缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡和坏死。