论文部分内容阅读
有机磷农药因药效好、种类多等优点,已被广泛用于我国农业生产,是目前使用量最广的一类农药。但随着生产力的提高,有机磷农药的乱用、滥用等情况越来越严重,导致食品和环境中有机磷农药残留量超标,对人类健康造成了威胁,甚至出现多起有机磷农药中毒事件,故迫切需要开发新技术以实现快速、灵敏检测食品和环境中的有机磷农药残留。适配体因具有高亲和性、成本低廉、靶标范围广泛和易于化学修饰等特点,在有机磷农药残留的检测方面有着巨大的应用潜能。因此有必要筛选得可识别多种有机磷农药的的适配体,为今后建立一种基于适配体的快速、灵敏检测有机磷农药残留的方法奠定基础。本研究基于磁珠-SELEX技术,筛选得到有机磷农药OP3的适配体,并对其性质进行了考察。主要工作如下:1、选择课题组自主合成的有机磷农药OP3和OP4作为候选靶标,将OP3和OP4分别和载体蛋白BSA、OVA偶联,得到四种偶联产物OP3-BSA、OP3-OVA、OP4-BSA、OP4-OVA,以紫外光谱法初步判断偶联是否成功,随后用生物质谱法计算并比较四种偶联产物的偶联比。发现OP3-BSA的偶联比最高,更有利于筛选,因此选择OP3作为靶标进行筛选。2、通过碳二亚胺法将偶联比最高的OP3-BSA固定在氨基磁珠上用于正筛选,将BSA固定在氨基磁珠上用于反筛选。将OP3-BSA-Beads和初级单链DNA(ssDNA)文库混合,于室温下反应45 min,随后用结合缓冲液洗去未结合的ssDNA。用洗脱缓冲液在95 ℃条件下将结合到OP3-BSA-Beads上的ssDNA洗脱。将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增,随后将扩增后的双链DNA(dsDNA)解链成ssDNA,并制成次级文库用于下一轮筛选。筛选共进行19轮,并利用BSA作为负靶标,进行了六轮反筛选,以除去与BSA具有亲和性的ssDNA。通过测定每轮文库中与OP3具有亲和性的ssDNA的富集情况,选出第14轮的文库进行高通量测序,并用mfold软件对测序丰度大于30的序列进行二级结构模拟,经过分析比较,得到共16条适配体序列。3、对这16条序列的亲和性进行初步表征,选出亲和性最高的4条适配体PES11、PES19、PES20、PES21进行解离常数(Kd)的测定。它们的 Kd 值分别为 276±13.4nM、28.99±4.57nM、28.85±3.3OnM、45.30±4.24 nM,说明这四条适配体都对OP3具有很高的亲和性。4、评价了这四条适配体对OP3、倍硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松、丰索磷、辛硫磷的结合能力,发现它们均能与至少两种农药结合,其中PES11能与上述七种农药结合,对农药的识别范围最广。