第二代生物燃料乙醇工业生产预处理过程中会产生大量有毒抑制物,这些抑制物会严重影响酿酒酵母菌的生长和发酵过程。其中,糠醛是最为主要的抑制物,因此克服糠醛等有毒抑制物的抑制效应是实现第二代生物燃料乙醇生产的关键因素。通过物理法、化学法以及生物学法可以去除糠醛等抑制物,但是这些方式会增加生物燃料乙醇的生产成本,同时去除效果有限。基于酿酒酵母自身具有糠醛脱毒耐受能力,现今国内外研究者在酿酒酵母对糠醛的脱毒耐受机理进行了许多基础性研究,发现了众多与糠醛耐受相关的转录调控基因。本实验通过PDR1、YAP1、RPN4转录调控基因联合过表达的方式构建工程酿酒酵母菌株,测定比较分析工程菌株与出发菌株在糠醛应激压力下的表型以及进行转录组测序数据分析。共得到以下实验结果:1.以YB-A-6-1工业酿酒酵母二倍体菌株作为出发菌株,选取TEF1p组成型强启动子和PDR1、YAP1、RPN4关键转录调控基因,通过酵母体内同源重组的方式构建出过表达PDR1基因的P菌株;分别以P菌株构建出过表达PDR1、YAP1基因的PY菌株与过表达PDR1、YAP1、RPN4基因的PYR菌株。通过菌株在糠醛应激条件下液体生长曲线的测定,综合得出3株工程菌株的迟滞期明显比出发菌株短,随着糠醛抑制剂浓度的增加,它们之间的迟滞期长短差异越来越大,在设定的最高浓度45 m M糠醛中,PYR工程菌生长迟滞期比PY短,PY的迟滞期比P短。在不加任何抑制剂的情况下,3株工程菌与出发菌之间均没有迟滞期,表现为大致相同的生长趋势。2.通过粗酶提取以及分别利用两种辅酶NADH和NADPH测定醛还原酶比活力。糠醛应激压力下,3株工程菌依赖于NADH的醛还原酶比活力有逐步比出发菌增强的趋势;糠醛应激压力下,3株工程菌依赖于NADPH的醛还原酶比活力明显低于出发菌株。通过酵母细胞壁抗性实验得到在糠醛应激压力下,出发菌的细胞壁抗性能力明显最弱,而3株工程菌株的细胞壁抗性能力均明显强于出发菌,工程菌之间的细胞壁抗性能力无显著差异。3株工程菌在85 m M 5-羟甲基糠醛、5.2 g/L乙酸、10.5%乙醇和13%玉米秸秆水解液中的生长迟滞期均比出发菌短,工程菌之间迟滞期无明显差异;P工程菌在1.8 g/L甲酸应激条件下的生长迟滞期最短,PY、PYR工程菌和出发菌的生长迟滞期无明显差异;3株工程菌与出发菌在1.6 g/L苯酚抑制条件下均没有生长迟滞期,仅表现为生长速率的差异。3.通过转录组测序数据初步得到工程菌糠醛耐受相关的显著上调和下调基因,其中显著上调的膜外排蛋白基因群主要集中在PY工程菌中;显著上调的细胞膜成分合成基因主要集中在PYR工程菌,CHS2参与细胞壁重要成分几丁质的合成,在3株工程菌中均为显著上调;损伤蛋白修饰和降解基因群在3株工程菌中均出现显著下调;显著上调的脱毒基因主要集中在PY工程菌;显著上调的磷酸戊糖途径相关的基因主要集中在PY和PYR工程菌,体现为代谢物PRPP（5-磷酸核糖-1-焦磷酸）合成的串联酶基因显著上调。4.通过转录调控关系分析得到Yap1p对下游基因HXT8、YJL163C、PDR10、PDR15、ICT1、URA7、YKL071W起到了显著间接上调作用,Yap1p是参与糠醛耐受功能基因调控的主导调控因子,转录调控基因的联合过表达并非是每个转录调控基因简单、叠加、孤立的调控,这涉及到转录调控因子之间的相互作用,转录调控因子对下游功能基因的间接调控等。本论文研究选取多效耐药相关的PDR1,氧化应激响应相关的YAP1,损伤蛋白降解相关的RPN4转录调控基因与组成型强启动子TEF1p成功构建了联合过表达转录调控基因PDR1、YAP1、RPN4工程菌,联合过表达PDR1、YAP1工程菌以及单个PDR1过表达工程菌。本论文从表型和分子层面研究分析了工程菌耐受机制以及转录调控关系,研究取得的成果使我们对转录调控基因联合过表达方式提高糠醛耐受性,糠醛耐受机制以及转录调控关系有了更深入的认识,这为今后进一步联合过表达更多不同功能的转录调控基因奠定了基础,以及对实现木质纤维素燃料乙醇的工业化生产具有重要的科学及实践意义。