研究背景大黄为蓼科植物(Polygonaceae)掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.)或药用大黄(Rheum offcinale Baill.)的干燥根及根茎,为我国最常用大宗中药材,主要分布于甘肃、四川、青海等地。大黄始载于《神农本草经》,在我国已有2500多年的药用历史,具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经等功效,广泛应用于内、外、妇、儿各科病证。现代研究表明大黄具有泻下、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗氧化、保肝利胆、降血脂等作用,而且不同的功效对应不同的药效物质基础,如蒽醌和番泻苷主要发挥泻下活性,而以儿茶素和没食子酸为代表的多元酚类主要起逐瘀通经作用。而且,有文献报道不同来源的大黄其优势活性不同。前期研究发现,不同基源、不同产地的大黄化学组成有较大差别,理论而言其优势活性也应该不同。但是无论是《中国药典》还是世界主流草药典如《欧洲药典》、《香港药典》和《日本药典》中大黄的质量控制都是只制定了蒽醌类成分或番泻苷的含量标准,而未考虑其广泛的药理活性和针对不同药效有不同物质基础的客观实际。因此,我们认为应该制定面向大黄不同功效的质量控制标准,这样才有助于临床的精准用药和药材资源的充分利用。目的通过谱效关系和组效关系研究,辨识大黄发挥泻下、抗肿瘤、抗炎及解热功效的活性成分,以这些成分为检测指标建立大黄面向不同生物活性的质量控制标准,为临床的精准用药提供依据。方法1、采用HPLC技术建立大黄药材的指纹图谱,对指纹图谱数据进行统计分析筛选出代表性样品。2、采用ICR小鼠模型,考察1中筛选出的典型样品灌胃给药后对小鼠排便、小鼠腹泻发生率和小鼠小肠推进率的影响。通过典型样品的化学成分差异与其活性差异的关联度分析辨识大黄泻下活性成分。3、采用MTT法考查28批大黄甲醇提取物对人肝癌HepG 2细胞增殖的抑制作用,计算IC50值。通过多元统计分析方法,将28批大黄指纹图谱数据与各批次药材的IC50值进行相关分析,辨识其抗肿瘤活性成分。4、考查28批大黄甲醇提取物对LPS刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)分泌TNF-α的影响,计算TNF-α分泌的抑制率;通过SPSS-pearson相关分析法将28批大黄指纹图谱数据与TNF-α分泌的抑制率进行相关,辨识其抗炎活性成分。5、采用色差仪对28批大黄样品进行测定,通过多元统计分析方法将28批大黄指纹图谱数据与对应批次药材的色度值L*、a*、b*进行相关分析,探讨大黄颜色与其化学成分的相关性,为大黄的“辨色论质”提供科学依据。6、利用干酵母致大鼠发热模型,考察大黄提取物及其不同极性萃取物对大鼠体温升高的抑制作用,确认大黄解热活性部位;采用UPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS技术对活性部位化学成分进行分析,辨识大黄解热活性成分。7、采用HPLC技术建立了大黄中芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷与大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷共7个蒽醌苷类成分的同步测定方法。以儿茶素为对照品,采用香草醛-硫酸显色法建立了大黄中缩合鞣质的含量测定方法。结果1、采用HPLC建立了 28批大黄药材的指纹图谱,选出了 28个共有峰,经LC-MS/MS推测了其中25个共有峰的结构,通过对照品比对指认了其中15个共有峰,包括7个蒽醌苷、5个游离蒽醌、番泻苷A、没食子酸和儿茶素。同一色谱条件下对这15个共有峰进行了含量测定。依据各样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度(RSI)将28批样品分为A、B两组,A组RSI≥0.88,B组RSI<0.88。A组样品中苷类(蒽醌苷+番泻苷A)成分的总含量显著低于B组。经PLS-DA分析选出A、B两组的典型样品分别为S10和S22。采用2015版药典方法测得S10和S22号样品的总蒽醌含量相当,分别为1.508%和1.602%,但总结合蒽醌含量相差甚远,前者为0.432%,后者为1.229%,该结果与本文指纹图谱分析及含量测定结果吻合。2、采用S10和S22号大黄样品的70%甲醇提取物灌胃给药ICR小鼠,结果发现S10和S22号大黄均有泻下活性,但S22泻下作用更强。前文已知二者差别主要在于S22号样品蒽醌苷含量显著高于S10号样品,因此蒽醌苷类成分是大黄泻下活性成分。3、28批大黄中,只有17批样品可计算出IC50值,其IC50值介于0.513～5.897mg·m L-1之间。统计分析结果显示,与大黄抗肿瘤活性具有强相关的成分有1个,为Emodin-1-O-β-D-glucopyranoside;中等强度相关的成分有 7 个,分别是 Procyanidin B-1,3-O-gallate、1-O-galloyl-2-O-cinnamoyl-glucose、1-O-galloyl-6-O-cinnamoyl-glucose、Chr ysophanol-1-O-β-D-glucopyranoside、Chrysophanol-8-O-β-D-glucopyranoside、Physcion-8-O-β-D-glucopyranoside和Aloe-emodin。弱相关的成分有10个,包括3个鞣质、2个蒽醌苷、1个酰基糖苷、1个未知化合物,以及Senatosine A、Emodin和Physcion。4、ELISA试验结果显示28批大黄中只有S1,S3和S7号样品在一定程度上对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α有抑制作用,但抑制活性均较弱,最大抑制率分别为20.8%、33.7%、8.8%。本结果显示在此模型下,大黄抗炎活性很弱。5、大黄中化学成分与颜色指数a*(红绿色)拟合效果最好,与颜色指数b*、L*的曲线拟合不理想,各点分布散乱。因此,可通过颜色指数a*值的变化来解释相关成分的变化。其中 Catechin、Procyanidin B-1,3-O-gallate、Procyanidin B-2,3,3’-di-O-gallate、(-)epicatechin-3-O-gallate、Rhein-8-O-β-D-glucopyranoside 和 Physcion-8-O-β-D-glucop yranoside与颜色指数a*的曲线拟合效果好,方差检验Sig.值均小于0.05,所得回归结果有统计学意义,可以较好的反映两者之间的关系。由Pearson相关系数相关分析结果可知,大黄的颜色指数a*(红绿色)与上述6种成分具有中等强度相关,且均为正相关,说明这些成分量越高,大黄颜色越红。6、组效关系研究结果显示,大黄乙醇提取物的正丁醇萃取部位和萃余水部位是其解热活性部位。经LC-MS/MS分析,从正丁醇部位推测了 33个化合物,包括10个鞣质类化合物(1个没食子酸,6个没食子酸糖苷,1个儿茶素,2个缩合鞣质),15个蒽醌苷,4个蒽酮苷,1个萘苷,1个简单酚苷,1个蒽醌和1个蔗糖,其中10个化合物的结构经对照品比对进行了确认。萃余水部位共推测了 12个化合物,包括5个没食子酸及其糖苷,6个蒽醌苷和1个蔗糖,这12个化合物均与正丁醇部位的化合物重叠。7、28批大黄中7种蒽醌苷的总含量介于0.539～2.577%之间,其中芦荟大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的含量范围为0.036～0.403%,大黄酸-8-O-β-D-葡萄糖苷为0.005～1.316%,大黄素-1-O-β-D-葡萄糖苷为0.005～0.141%,大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷为0.050～0.355%,大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷为0.113～1.064%,大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为0.165～0.436%,大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷为0.038～0.243%。28批大黄药材中缩合鞣质的含量范围在3.631～16.717%之间。结论1、蒽醌苷类成分是大黄发挥泻下作用的主要活性成分;蒽醌苷和鞣质类成分是大黄发挥抗肿瘤和解热作用的主要活性成分;蒽醌苷和鞣质类成分含量越高,大黄颜色越深,就泻下功效而言,大黄偏红棕色者较偏黄色者品质更佳。2、采用谱效关系进行中药活性成分辨识研究中,活性成分识别数量的多少很大程度上取决于指纹图谱中共有峰的数目的多寡,因此应采用质谱指纹图谱与中药活性进行相关,以识别更多的活性成分。