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研究目的肺癌已成为全球对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一,在我国肺癌的发病率和死亡率均高居所有恶性肿瘤的首位。手术治疗仍是目前唯一的可能治愈肺癌的手段,但是仅不足一半的患者有机会接受根治性手术治疗,术后5年生存率仅为30-60%。肺癌的侵袭和转移是影响患者疗效和生存的关键因素,但由于肺癌的发病和转移机制目前仍然不清楚,缺乏有效的治疗手段。因此,积极探索肺癌的侵袭转移的分子机制,寻找肺癌治疗的新方法,对提高患者预后有重要的现实意义。激活蛋白-1抑制因子(SARI,受干扰素调节),是一种受I型干扰素诱导的早期反应基因,是近年来发现的一种新型抑癌基因,可以选择性抑制肿瘤细胞的生长作用。SARI在多种正常组织细胞中均有表达,而在多种肿瘤中不表达或表达量下降。本课题小组的前期研究结果显示SARI与肺腺癌细胞的侵袭转移有明显的关系,然而其在肺癌组织中表达与调控机制尚不清楚。微小RNA(mi RNA)是一类内源性的单链非编码RNA,可以在转录后水平调控靶基因表达,mi RNA的表达异常在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。研究发现mi RNA-96在多种恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡及侵袭转移过程相关,呈癌基因的功能。在NSCLC中mi RNA-96的作用机制仍不明确,最近研究结果显示mi RNA-96在NSCLC中表达升高,在肺癌细胞系中mi RNA-96表达亦上调。本研究旨在明确SARI及mi RNA-96在NSCLC的表达情况,分析mi RNA-96对SARI可能的调控机制,并探讨对肺癌A549细胞迁移和侵袭能力的影响,为阐明NSCLC的转移机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。研究方法1、利用免疫组化法检测SARI蛋白在120例NSCLC患者的石蜡组织标本中的表达,分析SARI表达水平与NSCLC临床病理特征及预后之间的关系。利用RT-PCR方法分析30例NSCLC患者新鲜癌组织与癌旁组织标本中SARI m RNA的表达情况。2、利用q RT-PCR方法检测30例NSCLC患者新鲜癌组织与癌旁组织标本mi RNA-96的表达,分析其表达水平与患者临床病理因素的关系。进一步分析mi RNA-96与SARI在NSCLC中之间的表达相关性。3、验证mi RNA-96对SARI基因的靶向调控,利用Target Scan,mi Randa和Microcosm Targets等信息学软件分析mi RNA-96与SARI基因可能的作用位点,荧光素酶报告实验验证mi RNA-96对SARI的直接负性调控。在A549细胞中抑制mi RNA-96水平后利用RT-PCR和Western blotting法检测SARI m RNA和蛋白水平的改变。4、分析mi RNA-96调控SARI对A549细胞迁移侵袭能力的影响,在A549细胞中转染mi RNA-96 inhibitor后,MTT法检测细胞的增殖水平的变化,划痕实验和Transwell侵袭实验检测迁移侵袭能力的变化。利用RAN干扰法抑制SARI的蛋白表达,检测细胞迁移侵袭能力的改变。研究结果1、免疫组化法检测结果显示在NSCLC中SARI阳性率仅为41.7%(50/120),其中肺腺癌阳性率38.9%(21/54),鳞癌阳性率为43.9%(29/66)。RT-PCR结果显示在癌组织中SARI基因的m RNA相对表达水平明显低于癌旁组织中的相对表达水平(0.17±0.03 vs 0.51±0.11),倍数变化为0.33,差异具有统计学意义(P=0.028)。在NSCLC中SARI的表达水平与肿瘤分化程度、T分期、淋巴结转移以及肿瘤TNM分期等密切相关(P<0.05);多因素分析结果显示仅淋巴结转移及TNM分期与SARI的蛋白表达水平有关。生存分析结果显示SARI蛋白表达阳性者5年生存率明显高于阴性表达者(67.5%vs 41.6%,χ2=8.993,P=0.003),SARI表达是影响本组NSCLC患者预后的独立危险因素。2、q RT-PCR检测显示在NSCLC癌组织中mi RNA-96的平均表达水平为癌旁组织的2.16±0.92倍,差异有统计学意义(2-ΔΔCt>1,P<0.05)。mi RNA-96表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况以及T分期显著相关(P<0.05);与患者的性别、年龄、吸烟状态、病理类型、肿瘤部位等无相关(P>0.05)。相关性分析结果显示在NSCLC中mi RNA-96表达水平与SARI m RNA的表达水平呈负相关性,(r2=0.623,P=0.019)。3、生物信息学分析提示SARI可能是mi RNA-96的靶基因。荧光素酶报告基因实验结果显示mi RNA-96能够抑制含有结合位点的SARI荧光素酶报告基因的活性,而对突变体及对照组质粒的荧光强度没有影响。在A549细胞中抑制mi RNA-96表达后SARI m RNA和蛋白水平均升高。4、抑制A549细胞中mi RNA-96表达后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显的受到抑制;而用下调SARI的表达水平能促进细胞的迁移和侵袭;共转染实验结果显示mi RNA-96 inhibitor对肿瘤细胞的迁移及侵袭的抑制作用可以部分地被SARI si RNA削弱。研究结论1、在NSCLC组织中SARI表达下降,其表达水平与淋巴结转移、TNM分期及预后相关;抑制SARI的表达后,细胞的迁移和侵袭能力增强,结果提示SARI在NSCLC的侵袭转移过程中发挥抑制作用。2、在NSCLC中mi RNA-96表达升高,其表达水平与肿瘤细胞分化、淋巴结转移及T分期相关;抑制mi RNA-96表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著下降,提示mi RNA对NSCLC侵袭转移有促进作用。3、SARI为mi RNA-96直接调控的靶基因,mi RNA-96通过抑制SARI的表达促进肿瘤细胞的侵袭和转移。