前言大蒜是一种含有多种有机硫化合物的植物,其中最重要的有效成分之一是大蒜素。人们用大蒜来治疗感染,枪伤,蛇咬,腹泻,风湿,心脏病,糖尿病以及其它的一些生理功能紊乱,人们在实验中还发现其具有降血脂、降血压、降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗氧化和免疫调节等功效。大蒜来源的有机硫化合物对一些人类肿瘤,如前列腺癌,胸腺癌,结肠癌,肺癌,膀胱癌等有很好的抑制作用。大蒜的化学组成十分复杂,其中有生物活性的成分超过100种。其中最重要和最独特的是有机硫化合物的含量非常高,是其他含有高硫的蔬菜如洋葱、椰菜的4倍多。近年来日本学者发现在控制湿度和温度的情况下,普通的白大蒜可以经过处理转化为黑大蒜。黑大蒜去除了大蒜的异味,带有甜味,口感好,无需再经处理即可直接食用。已有研究报道黑大蒜较白大蒜含有更多的氨基酸、有机硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸,因此与白大蒜相比,更具有应用前景。然而目前有关黑大蒜对机体免疫功能影响国内外尚未见报道。为此,本实验应用自制的黑大蒜提取物溶液,将腹腔注射给小鼠,观察了黑大蒜提取物作为免疫调节剂的作用,为黑大蒜的实际应用进一步提供理论和实验依据。实验材料一、主要试剂黑大蒜提取物(干粉,由日本弘前大学佐佐木甚一教授惠赠),RPMI1640培养基,小牛血清,0.01M PBS缓冲液,红细胞裂解液,LDH底物液,Griess试剂,IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-αELISA试剂盒。二、实验动物BALB/c小鼠,6-8周龄,SPF级,购自中科院上海实验动物中心。实验方法一、实验动物分组及处理40只BALB/c小鼠随即分为8组,其中第1-7组为实验组,第8组为对照组。将黑大蒜提取物用生理盐水配制成1mg/ml的溶液。实验组每天腹腔注射100μl的黑大蒜提取物溶液,对照组每天腹腔注射100μl的生理盐水。连续注射5天。于末次注射后的1-7天,从第1组开始,每天处死一组小鼠,第8组小鼠于第7天处死。二、样品的采集与检测1、脾细胞分离及其悬液的制备颈椎脱位处死小鼠,常规制备脾细胞悬液,调整细胞浓度至1×107／ml。2、ELISA法检测脾细胞培养上清中Th1细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ以及Th2细胞因子IL-4的分泌水平3、LDH释放法检测NK细胞的杀伤活性4、Griess法检测脾细胞培养上清中NO分泌水平5、RT-PCR半定量技术检测脾细胞FasL mRNA的表达水平三、统计学处理实验数据经SPSS 16.0统计分析软件应用t检验进行统计处理,P<0.05有显著性差异。结果1、NK细胞杀伤活性的检测结果在连续5天给予BALB/c小鼠注射黑大蒜提取物后,比较实验组和对照组小鼠的NK细胞杀伤活性,结果表明：与对照组(5.82±1.38%)相比,黑大蒜提取物处理4-6天后,实验组小鼠的NK细胞杀伤活性显著性升高,并在第5天达到峰值(11.21±1.17%),随后下降。2、脾细胞培养上清中细胞因子水平的检测结果本实验中我们检测了Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α和Th2细胞因子IL-4的分泌水平。我们发现在给予小鼠连续注射5天黑大蒜提取物后,IL-2的分泌水平在处理后第6天有明显升高,与对照组(20.14±3.88pg/ml)相比,有显著的统计学意义(P<0.05)。TNF-α的水平从处理后第1天就开始明显升高(P<0.01),在第3天达到峰值(68.73±0.64pg/ml),随后下降,但一直到第7天,均高于对照组(27.36±8.30pg/ml)。IFN-γ的分泌水平在处理结束后也有显著升高,其中在第3天达到峰值(105.05±55.73 pg/ml),随后下降,到第7天接近对照组水平(17.38±1.19 pg/ml)。Th2细胞因子IL-4的水平在处理后其分泌水平一直低于对照组(19.98±2.13 pg/ml),其中第3、4、5天的表达水平均显著低于对照组(P<0.01),但是变化均在基线范围内。3、脾细胞培养上清中NO含量的检测结果从黑大蒜提取物处理后的第3天到第7天,实验组小鼠NO2-始终处于较高的水平,与对照组相比(11.58±0.86μM),均具有显著性差异(P<0.001)。4、脾细胞FasL mRNA表达水平的检测结果通过半定量RT-PCR技术检测了小鼠脾细胞FasL mRNA的表达水平。处理结束后的第1天至第7天,各天脾细胞FasL mRNA的表达水平与对照组相比均未见显著性差异(P>0.05)。结论1、黑大蒜提取物可以增强NK细胞的杀伤活性。2、FasL mRNA的表达水平并未增高,提示黑大蒜提取物未诱导杀伤细胞通过Fas/FasL途径发挥效应。3、黑大蒜提取物可使脾细胞NO的分泌水平明显增高,提示黑大蒜提取物可能有增强固有免疫细胞巨噬细胞活性的作用。4、黑大蒜提取物能增强IL-2、IFN-γ、TNF-α的产生水平,提示黑大蒜提取物能够促进Th1型免疫应答。