高氧机械通气是治疗严重呼吸衰竭,尤其是急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的常用措施,但常时间暴露在高氧状态下会导致肺上皮细胞损伤、死亡、致急性肺损伤(acute lung injury, ALI)甚至呼吸功能衰竭。近年支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)在全球发病率逐年增高,存活者常伴有明显肺发育障碍和功能低下,目前国际上尚无确定有效的防治方法,但大量临床资料显示其病因与高氧性肺损伤密切相关。研究发现,高氧性肺损伤早期特征性改变是肺泡炎性水肿,继之出现肺间质增生和纤维化,最终导致呼吸功能的完全丧失。如果早期干预性治疗能使肺水肿液迅速重吸收,就可能改善低氧血症,减少氧气的使用浓度和时间,从而逆转肺损伤,并阻断后续的肺间质增生和肺组织纤维化。水通道蛋白(aquaporins, AQPs)是一组与水分子通透有关的特异型细胞膜转运蛋白,目前发现在肺组织和气道至少有4种AQPs(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5)的表达并参与肺液体转运, AQP5作为肺泡上皮细胞(AEC)分化的标志物之一,对其在肺泡水代谢的作用机制是近年来的研究热点。多项研究表明在肺部炎症、水肿状态下AQP5基因表达失衡,提示AQP5在肺泡细胞的水平衡调节上有重要的作用。因而我们推测高氧性肺损伤肺泡炎性水肿可能存在氧自由基攻击导致AQP5的基因表达调控失衡,从而导致肺水肿时肺泡液体清除率(Alveolar fluid clearance,AFC)下降。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)是活性氧自由基(reacive oxygen species,ROS)调节基因表达的重要途径之一,主要包括三类亚族:细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38、c-氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase /Stress-activated protein kinase,JNK/SAPK)。MAPK通过调节大量不同效应蛋白的磷酸化作用,最终导致基因表达改变。有依据显示AQPs表达可被生长因子、炎症介质、渗透性应激所调节,同时研究还揭示了不同应激情况下AQPs基因表达与MAPK信号级联反应之间存在一定的相关性,但是对于氧化应激时AQPs与MAPK二者的关系,MAPK途径是否参与高氧性肺损伤中AQPs的表达调控,至今尚不清楚。综上所述,ROS作为重要的信号转导分子,可能通过MAPK途径参与高氧性肺损伤中AQP5的表达调控,通过调控ROS水平或针对MAPK激酶途径进行干预,进而促进肺水肿液迅速重吸收,将是未来高氧肺损伤和BPD防治的可行性途径。本课题通过对高氧肺损伤肺组织以及肺泡上皮细胞株AQP5基因表达进行体内、体外实验研究,明确其在高氧性肺损伤中的具体作用和意义,并探询MAPK转导途径对AQP5的调控机制。第一部分MAPK通路对H2O2刺激状态下MLE-12细胞AQP5表达的调控背景MLE-12是小鼠来源的肺上皮细胞株,在研究肺泡上皮细胞膜蛋白表达及调节方面具有良好的特异性。已有研究证实,暴露于95%氧气以及H2O2应激可触发转录因子AP-1及MAPK家族p38、JNK成员的持续激活,从而介导高氧所致肿胀性细胞死亡以及细胞凋亡,且细胞的存活率在特异性抑制剂抑制MAPK活化的同时得到明显的改善。AQP5在维持肺液体平衡以及肺水肿形成中具有关键性作用,已有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)对MLE-12细胞AQP5蛋白及mRNA表达影响的报道,但对于高氧诱导下细胞AQP5表达的相关研究还知之甚少。本研究拟复制氧化攻击细胞模型,研究离体氧化模型AQP5表达的变化,并通过MAPK信号途径抑制剂阻断其蛋白激酶的活化,观察其对高氧应激下MLE-12细胞AQP5表达的影响,为急性肺损伤修复探索新的方法。目的1.建立氧化性细胞模型2.观察不同浓度、不同时间H2O2刺激对MLE-12细胞MAPK(ERK、JNK、p38)的影响。3.观察不同浓度、不同时间H2O2刺激对细胞AQP5表达的影响。4.使用MAPK信号抑制剂,研究其对MLE-12细胞AQP5表达的影响,探讨MAPK途径是否参与了MLE-12细胞AQP5的表达。方法1.贴壁培养MLE-12, H2O2作为外源性ROS,选用不同作用浓度(125μM、250μM、500μM、1000μM)H2O2刺激1小时及250μM H2O2作用不同时间(0、15min、30min、1h、3h、5h),复制氧化性细胞损伤模型。2. Western blot法检测氧化损伤细胞磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表达并采用相关抑制剂(分别为PD98059、SB203580、SP600125)阻断MAPK蛋白表达。3.分别用Western blot法和FQ-PCR法检测氧化损伤细胞AQP5蛋白及mRNA基因表达,并选用MAPK信号通路抑制剂作用细胞,研究阻断MAPK信号途径表达后AQP5基因表达的影响。结果1. MLE-12细胞磷酸化MAPK蛋白表达随H2O2刺激浓度升高而逐渐增加,与对照组比较,ERK、p38及JNK三亚族在125μM H2O2刺激下蛋白表达即明显增加(P<0.05),1000μM时最强,呈浓度依赖性。2. MLE-12细胞随H2O2作用时间延长,磷酸化MAPK蛋白表达呈上升趋势,ERK、p38表达均在H2O2作用1h最强,但ERK在作用3h后即降至正常, p38在H2O2 5h后仍高于正常对照组;JNK蛋白表达在H2O2作用3h最强,第5h与正常对照组比较无明显差异。3.选用ERK抑制剂PD98059 20μM、p38抑制剂SB203580 20μM、JNK抑制剂SP600125 25μM均能抑制磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达。4. Western blot结果显示:对照组AQP5蛋白呈阳性表达,在250μM H2O2刺激时即表达降低,后随浓度增加呈逐渐降低趋势;在250μM H2O2氧化刺激不同时间时,AQP5蛋白表达总体呈降低趋势。不同MAPK抑制剂干预组仅见SB203580组AQP5蛋白表达较相应H2O2刺激组增高。5. FQ-PCR结果显示:随H2O2刺激浓度增高,AQP5 mRNA表达呈逐渐降低趋势,以500μM H2O2刺激时表达最低;在250μM H2O2作用不同时间,AQP5mRNA水平随氧化攻击时间的延长总体呈降低趋势。MAPK抑制剂干预组仅见SB203580组对AQP5mRNA表达有影响。结论采用不同浓度及不同作用时间H2O2攻击MLE-12作为研究高氧应激的体外细胞模型,H2O2能触发MAPK信号家族ERK、p38、JNK的激活,信号通路抑制剂可有效抑制三亚族的蛋白表达;H2O2使MLE-12细胞AQP5 mRNA及蛋白表达呈降低趋势,抑制MAPK信号途径中p38的表达可阻断氧化应激状态下AQP5基因表达的降低。第二部分MAPK通路对高氧肺损伤动物肺组织AQP5表达的调控背景急性肺损伤(ALI)及急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)起病急骤,发病持续,是多种高危因素引起的临床危重疾病。近年来炎症反应在ALI及ARDS发病中的地位受到越来越多的关注。氧自由基是重要的炎症介质,多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞均能产生氧自由基,并参与肺损伤。随着活性氧概念的扩展和延伸,氧气在广义上也属于活性氧的范畴。吸入高浓度氧导致急性肺损伤在临床中屡有发生,尽管大量的动物实验研究显示在肺损伤和肺水肿形成中AQP5发挥着重要作用,但对于高氧性肺损伤中AQP5的研究资料有限,对MAPK信号通路与高氧肺损伤二者相关性的动物实验研究少有报道。本试验拟建立高氧诱导ALI模型,探讨AQP5在高氧诱导ALI的表达变化,并通过阻断MAPK信号通路,研究其对AQP5基因表达的影响,探明MAPK信号通路参与高氧诱导ALI调节AQP5的可能性,为有效控制AQP5在肺损伤的表达失衡提供实验基础。目的1.建立幼鼠高氧诱导ALI模型。2.观察高氧暴露对肺组织MAPK(ERK、p38、JNK)的影响并摸索在体动物有效抑制MAPK蛋白表达的抑制剂浓度。3.观察高氧暴露对肺组织AQP5基因表达的影响,并应用MAPK通路抑制剂,干预前后进行对比分析,探讨AQP5的分子调控机制。方法1.实验动物分组:幼年3周龄Wistar大鼠,随机分为如下各组(n=6):A组,空气对照组;O3组,高氧暴露3天组;O7组,高氧暴露7天组;O14组,高氧暴露14天组;O7+PD组,静脉注射ERK抑制剂PD98059后行高氧暴露7天;O7+SB组,静脉注射p38抑制剂SB203580后行高氧暴露7天;O7+SP组,腹腔注射JNK抑制剂SP600125后行高氧暴露7天;且同时设立抑制剂对照组(A+PD组、A+SB组、A+SP组)。2. Western blot检测肺组织磷酸化MAPK(ERK、p38、JNK)蛋白表达,并探讨在体实验中抑制剂阻断MAPK蛋白表达的有效浓度;免疫组化分析MAPK蛋白在肺组织的分布。3.分别用Western blot法和IHC法检测高氧肺损伤肺组织AQP5蛋白表达,FQ-PCR法分析AQP5 mRNA基因表达。并选用MAPK抑制剂阻断MAPK蛋白表达,研究其对AQP5基因表达的影响。结果1.高氧诱导ALI的建立:实验动物置于高氧舱中,连续行氧浓度监测,保证氧浓度≥95%,高氧暴露组动物肺组织出现炎性细胞浸润、水肿、出血、肺泡结构破坏等肺损伤病理改变。2.与空气对照组比较,各高氧暴露组ERK、p38、JNK蛋白表达明显增强,phospho-ERK、phospho-JNK在O7组表达升高最为明显(P<0.05),phospho-p38在O14组表达最强(P<0.05);抑制剂PD98059在静脉注射0.3mg/kg时即表现出对ERK蛋白表达的抑制作用,而静脉注射SB203580 0.2mg/kg、腹腔注射SP600125 15mg/kg可有效抑制p38、JNK的蛋白表达,且抑制效应随抑制剂浓度的递增呈增强趋势。3.空气对照组仅肺泡上皮细胞及气道上皮细胞少量磷酸化MAPK阳性表达,高氧肺损伤各组阳性细胞数明显增多,广泛分布在肺内不同细胞类型中,其中p38阳性表达尤多见于浸润炎性细胞。4. AQP5主要表达于肺泡I型上皮细胞及气道分泌上皮顶质膜,与空气对照组比较,高氧损伤各组阳性细胞表达明显减少;Western blot分析见AQP5蛋白表达随高氧暴露时间的延长呈降低趋势,尤以O7组最为明显;AQP5mRNA也随高氧暴露时间增加而逐渐下调。5. MAPK抑制剂干预后,O7+SB203580、O7+SP600125组肺组织病理形态有明显改善,且其AQP5蛋白及mRNA表达较高氧损伤组增加;而PD98059抑制剂组未见干预前后高氧肺损伤肺组织AQP5基因表达的变化。结论成功复制幼年Wistar大鼠高氧诱导ALI模型,高氧暴露可激活MAPK信号通路ERK/p38/JNK,选用抑制剂适当浓度即可有效阻断MAPK的蛋白活性;高氧肺损伤时AQP5蛋白及mRNA表达降低,三种抑制剂(PD98059/SB203580/SP600125)干预组可见p38抑制剂、JNK抑制剂上调高氧肺损伤时AQP5基因表达,因此在体实验研究表明p38、JNK参与了高氧诱导ALI模型AQP5基因表达的调节。